[发明专利]一种HCBP6基因敲除细胞系及其构建方法

权利要求书

1.一种构建HCBP6基因敲除细胞系的方法，是采用CRISPER/Cas9技术构建HCBP6基因敲除细胞系，其特征在于：所述方法以HCBP6蛋白的编码序列中SEQ ID No.6或SEQ ID No.7为靶序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法为如下方法A或方法B：

方法A，包括如下步骤：

（a1）合成名称为正向单链DNA1和名称为反向单链DNA1的两个单链DNA；所述正向单链DNA1的序列如SEQ ID No.8所示；所述反向单链DNA1的序列如SEQ ID No.9所示；

（a2）将所述正向单链DNA1和所述反向单链DNA1进行退火反应，得到双链DNA1；

（a3）将所述双链DNA1连接到LentiCRISPRv2质粒的限制性内切酶BsmB I的切割位点处，得到的重组质粒记为LentiCRISPRv2-HCBP6-1；

（a4）将psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和步骤（a3）构建的重组质粒LentiCRISPRv2-HCBP6-1共转染人胚肾细胞HEK 293T，得到重组细胞，培养所述重组细胞得到慢病毒上清；

（a5）将步骤（a4）得到的慢病毒上清感染HepG2细胞，从感染后的细胞中获得HCBP6基因被敲除的细胞系；

方法B，包括如下步骤：

（b1）合成名称为正向单链DNA2和名称为反向单链DNA2的两个单链DNA；所述正向单链DNA2的序列如SEQ ID No.10所示；所述反向单链DNA2的序列如SEQ ID No.11所示；

（b2）将所述正向单链DNA2和所述反向单链DNA2进行退火反应，得到双链DNA2；

（b3）将所述双链DNA2连接到LentiCRISPRv2质粒的限制性内切酶BsmB I的切割位点处，得到的重组质粒记为LentiCRISPRv2-HCBP6-2；

（b4）将psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和步骤（b3）构建的重组质粒LentiCRISPRv2-HCBP6-2共转染人胚肾细胞HEK 293T，得到重组细胞，培养所述重组细胞得到慢病毒上清；

（b5）将步骤（b4）得到的慢病毒上清感染HepG2细胞，从感染后的细胞中获得HCBP6基因被敲除的细胞系。

3.质粒，其特征在于：所述质粒为权利要求2中所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-1或者LentiCRISPRv2-HCBP6-2。

4.成套质粒，其特征在于：所述成套质粒由psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和权利要求2中所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-1组成；或者由psPAX2质粒、pCMV-VSVG质粒和权利要求2中所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-2组成。

5.权利要求3所述质粒或权利要求4所述的成套质粒的用途，其特征在于：所述用途为基于CRISPR-Cas9敲除HepG2细胞中的HCBP6基因。

6.用于构建HCBP6基因敲除细胞系的试剂盒，含有权利要求3所述的质粒或权利要求4所述的成套质粒及说明书；所述说明书中记载有权利要求1或2所述的方法。