[发明专利]一种HCBP6基因敲除细胞系及其构建方法

说明书

本发明公开了一种HCBP6基因敲除细胞系及其构建方法。本发明所提供的构建HCBP6基因敲除细胞系的方法，是采用CRISPER/Cas9技术构建HCBP6基因敲除细胞系，所述方法以HCBP6蛋白的编码序列中符合5’‑N_X‑NGG‑3’或5’‑CCN‑N_X‑3’序列排列规则的片段为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。本发明为HCV感染机制研究打下基础。本发明构建的HCBP6基因敲除是在基因组水平上形成移码突变，故可以随着细胞的分裂、增殖传递到下一代，形成稳定的HCBP6基因敲除细胞系。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种HCBP6基因敲除细胞系及其构建方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原之一。目前主要的治疗手段是干扰素加利巴韦林，但是效果不十分理想，特别是不能用于肝硬化失代偿期的患者。因此，进一步深入研究HCV的发病机制，研制新型抗病毒药物具有十分重要的意义。

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6(Hepatitis C Virus Core-Binding Protein6)是一种可以与丙型肝炎病毒核心蛋白相结合的蛋白。研究发现，HCBP6蛋白能够上调和下调一系列不同基因的表达水平，这些差异表达的基因与细胞信号的转导、增生、分化及生长调节密切相关。鉴于HCBP6在细胞核酸代谢和HCV感染中的重要作用，敲除HCBP6蛋白在HCBP6的功能研究中是十分重要的手段。但目前敲除或降低HCBP6表达的方法仅限于RNAi，该方法仅能瞬时降低HCBP6蛋白的表达，不能形成稳定敲除，更难以建立HCBP6表达缺失的细胞系，而且降低的程度也有限，不能完全敲除HCBP6的表达。因此，有必要研发一种从基因组中完全敲除HCBP6基因的方法。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/cas，规律成簇的间隔短回文重复序列)技术又称为CRISPR/Cas9(CRISPR associated protein9，CRISPR相关蛋白9)核酸酶技术是新出现的一种基因组编辑工具，它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。crRNA(CRISPRderived RNA，CRISPR衍生RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA，反式激活RNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9核酸酶蛋白在crRNA引导序列的靶定位点剪切双链DNA，从而达到对基因组DNA进行剪切或修饰的目的。

CRISPR/Cas9技术的定点剪切编辑技术最常用的是针对单个位点设计sgRNA引导Cas9在靶标序列上进行定向剪切，切割后细胞内固有的非同源末端连接途径(NHEJ)修复过程，会造成碱基的插入与删除，进而造成目的基因移码突变来实现基因敲除的目的。

目前，尚未见有关利用CRISPR/Cas9系统将HCBP6基因序列进行敲除的报道。

发明内容

本发明的目的是针对目前瞬时敲除HCBP6方法的不稳定性和不彻底性，提供一种从基因组中稳定敲除HCBP6基因的方法，该方法除用于HCBP6功能研究外，还可以用于建立HCBP6表达缺失细胞系。

第一，本发明要求保护一种构建HCBP6基因敲除细胞系的方法。

本发明所提供的构建HCBP6基因敲除细胞系的方法，具体是采用CRISPER/Cas9技术构建HCBP6基因敲除细胞系，其特征在于：所述方法以HCBP6蛋白的编码序列中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列规则的片段的“Nx”为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；