[发明专利]特异性双酚A羊多克隆抗体及其应用

说明书

本发明公开一种特异性双酚A羊多克隆抗体及其应用，该抗体主要通过如下步骤获得：(1)将双酚A通过琥珀酸酐和载体蛋白进行偶联，制备免疫原；(2)将上述免疫原免疫波尔山羊，制备羊抗血清；(3)从羊抗血清中纯化分离制备特异性双酚A羊多克隆抗体。本发明首次通过制备双酚A完全抗原，免疫山羊获得特异性双酚A羊多克隆抗体，快速、简单，生产效率高，生产成本低，亲和力强，特异性强，可用于后续双酚A的ELISA检测；而且本发明还提供了特异性多克隆抗体的纯化方法，获得的抗体直接采用抗血清用于检测，就可以排除动物血清中白蛋白、转铁蛋白、非特异性免疫球蛋白的干扰，检测结果更加准确，能准确反映样本中双酚A的真实含量。

技术领域：

本发明涉及免疫检测技术领域，具体的涉及一种特异性双酚A羊多克隆抗体及其应用。

背景技术

双酚A(BPA)学名为2，2-二(4-羟基苯基)丙烷，主要用于合成聚碳酸酯、环氧树脂等多种高分子材料。聚碳酸酯是一种透明的硬塑料，常用于制造婴儿奶瓶的瓶体，环氧树脂则常被用作婴儿奶粉罐、饮料纸盒内部材质。多数研究发现双酚A具有类雌激素的特点，对哺乳动物的神经系统、免疫系统、生殖系统都会产生一系列的不良影响，对人类的健康存在着较大的风险，而且双酚A易通过食品包装材料、容器以及塑料薄膜等渗入食品而进入体内。加拿大2008年成为首个将双酚A视为有毒物质的国家；日本《食品卫生法》规定聚碳酸酯食品容器中的双酚A溶出限量为2.5mg/kg；欧盟2011年禁止所有含双酚A的奶瓶进入欧盟市场，2014年又公布玩具中双酚A的限量指令，并于2017年最新修订了双酚A的迁移量限值由0.1mg/L降低至0.04mg/L；GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》明确规定了饮用水中双酚A含量不得超过0.01mg/kg。

鉴于双酚A的广泛残留风险和对人体的伤害风险，建立快速、有效、准确的双酚A检测方法具有重要的意义。目前双酚A的检测方法主要有：液相色谱法、液相色谱质谱联用法、气相色谱法、极谱法、荧光法等。上述方法选择性好、检测灵敏度高，可用于微量检测，但是均存在对设备仪器要求高、投入成本大、分析成本高，样本需要复杂前处理过程，难以做到快速、自动化检测，特别是无法适合大批量样品的高通量快速检测。

酶联免疫分析法是一种基于抗原抗体结合特异性反应和酶反应的灵敏性而建立的进行定性、定量快速检测的方法。它具有特异性强、灵敏度高的特点，可以快速进行高通量检测，特别适合于大批量样品的快速筛查。目前，有报道用BPA与牛血清蛋白(BSA)偶联制备免疫抗原，并免疫新西兰大白兔获得抗血清，制备兔多克隆抗体的，如有的文献中介绍了兔抗双酚A多克隆抗体的制备新西兰大白兔免疫，第4次免疫7d后从耳缘静脉采血，采用间接酶联免疫法测定抗血清效价；此外也有文献报道采用新西兰长耳兔免疫后，心脏采血，并离心获得抗血清；但上述的兔多克隆抗体具有产量低、生产工作量大、成本高，尤其是所获得抗体具有亲和力低、检测灵敏度低的缺点，同时报道中也没有提出特异性多克隆抗体的纯化方法，而是直接采用抗血清用于检测，难以排除动物血清中白蛋白、转铁蛋白、非特异性免疫球蛋白的干扰，往往导致检测结果异常，不能准确反映样本中双酚A的真实含量。总之，上述抗体不足以满足大批量双酚A待检样品的快速处理。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提出了一种特异性双酚A羊多克隆抗体(的制备方法)，该抗体生产工艺简单，生产量大、成本低，抗干扰能力强，获得的羊多克隆抗体具有特异性强，只与双酚A进行免疫结合，抗体亲和力高、检测灵敏度高的优点。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种特异性双酚A羊多克隆抗体，该抗体主要通过如下制备步骤获得：

(1)将双酚A通过琥珀酸酐(丁二酸酐)和载体蛋白进行偶联，制备免疫原(双酚A免疫原)；

(2)将上述步骤(1)制备的免疫原免疫波尔山羊，制备羊抗血清；

(3)从羊抗血清中纯化分离制备得到特异性双酚A羊多克隆抗体。