[发明专利]一种用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法及试剂

权利要求书

1.一种用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备基因组DNA作为随机待检标本；

2)合成Vel-对照品质粒pVel-：选取SMIM1c.64_80纯合缺失突变序列插入载体质粒pUC57-Simple进行合成制得；

3)调节对照品质粒pVel-的使用浓度，使对照品质粒pVel-与随机待检标本所含模板的摩尔数在同一数量级；

4)针对SMIM1野生型和SMIM1c.64_80缺失突变序列分别设计并合成特异性扩增引物，分别命名为+p和-p；

5)确定最适样本汇集数(n)：将不同数量(1，3，5，......n-1)的随机待检标本与对照品质粒pVel-汇集，分别模拟2样、4样、6样......n样汇集，使用-p进行PCR-SSP，采用琼脂糖凝胶检测扩增结果；根据扩增效果，并结合参与汇集的单个随机标本的DNA浓度，选定最适的汇集标本数；

6)将基因组DNA标本每n样进行汇集，使用-p进行PCR-SSP；对照品质粒pVel-作为实验体系的质控品以及Vel-个体的阳性对照同时被扩增；

7)对步骤6)中扩增出现特异性目的条带的汇集，即有反应性汇集，进行拆分检测；使用+p和-p两种引物分别扩增有反应性汇集中的单个标本，根据反应格局判断汇集中每个标本的基因型为野生型、杂合缺失突变序列或纯合缺失突变序列；

8)对杂合缺失突变序列或纯合缺失突变序列进行基因测序分析鉴定基因型。

2.根据权利要求1所述的用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所选SMIM1c.64_80纯合缺失突变序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法，其特征在于，所述步骤3)中，对照品质粒pVel-浓度调整如下：

载体质粒pUC57-Simple大小为2710bp，插入SMIM1c.64_80纯合缺失突变序列后合成的对照品质粒pVel-共计3318bp，对照品质粒pVel-浓度为1ng/μl；基因组DNA长度为3×109bp，经NanoDrop2000测定基因组DNA平均浓度数量级在100ng，故相同体积的两种模板其所含有效模板的摩尔数相差10000倍，因此使用对照质粒与随机标本模拟汇集时，应将质粒再稀释10000倍使用。

4.根据权利要求1所述的用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法，其特征在于，所述步骤4)中，+p引物序列如序列表中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示；-p引物序列如序列表中SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5所示。

5.根据权利要求1所述的用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法，其特征在于，所述步骤7)中，反应格局有如下几种情况：若随机待检标本只有经+p扩增时出现特异性目的条带，则该随机待检标本SMIM1为野生型序列，表型为Vel+；若随机待检标本只有经-p扩增时出现特异性目的条带，则该随机待检标本SMIM1为c.64_80纯合缺失序列，表型为Vel-；若随机待检标本经+p和-p扩增时均出现特异性目的条带，则该随机待检标本SMIM1同时含有野生型和缺失突变序列，即为杂合缺失突变，表型可能为Vel+W，即弱Vel。

6.根据权利要求1所述的用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法，其特征在于，所述步骤8中所使用的测序引物序列如序列表中SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示。