[发明专利]一种用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法及试剂

说明书

本发明公开了一种用于筛查Vel阴性血型基因的PCR‑SSP的方法及试剂，首先针对Vel血型基因SMIM1野生型序列和SMIM1 c.64_80缺失突变序列分别设计特异性扩增引物（文中分别用+p和‑p表示）；确定最适汇集标本数，将标本按一定数量（n）进行汇集；使用缺失突变序列特异的引物‑p扩增汇集标本。由于缺失突变序列为稀有序列，那么出现特异性目的条带的有反应性汇集是少数，此过程即可将筛查工作的时间和经济成本降低n倍。针对出现的有反应性汇集，则同时用+p和p两种引物分别扩增汇集中的单个标本，可初步判断参与汇集的单个标本的基因型，通过基因测序验证标本基因型。本发明可特异准确地鉴定Vel血型基因，并可大大降低筛查工作的时间及经济成本，提高筛查效率。

技术领域

本发明涉及基因分型检测方法，具体是一种用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法及试剂。

背景技术

Vel血型是2013年新近命名的第34个血型系统，该系统只有一种抗原Vel，Vel表达于绝大多数红细胞表面，Vel表达阴性(Vel-)为稀有表型。抗-Vel可导致严重的血管内溶血反应和新生儿溶血病。研究发现，抗原Vel由位于1号染色体的SMIM1编码表达，该基因含有4个外显子，其中编码区位于第3、4外显子，当第3外显子发生c.64_80连续17个核苷酸的纯合缺失突变时，蛋白翻译的读码框发生改变使得翻译过程提前终止，血型蛋白SMIM1不表达，产生Vel-稀有表型。当第3外显子发生17个核苷酸的杂合缺失突变时，由于Vel抗原的表达量也受到第2内含子中SNP rs1175550的调控，Vel抗原的表达量存在很大幅度的差异，有的接近正常Vel+，有的则表达量极低近乎Vel-。

目前国际上关于Vel血型血清学研究所使用的抗体主要来自因输血或者怀孕体内产生了抗体的Vel-个体，用Vel+的红细胞经吸收、放散、纯化后才可用于血清学筛查；而且来自不同个体的抗血清其效价和活性也相差很大，给血清学筛查带来了诸多不便和不稳定因素。对于杂合缺失个体因Vel抗原表达量复杂各异则容易造成假阴性的筛查结果。Vel-表型产生的分子机制单一、明确，因此采用基因分型的方法针对c.64_80del等位基因进行PCR-SSP可避开经典血清学的不足之处。

国外报道的Vel-的比例较低，其中欧洲地区约1/4000，高加索地区约1/5000，德国Vel-比例约在1/2000，瑞典北部Vel-个体的比例稍高，约为1/1762。我国关于Vel血型的研究很少，参照国际上Vel-的比例，要寻找Vel-稀有个体可能需要大规模的筛查样本，也就意味着巨大的时间和经济成本。因此，根据Vel-产生的特殊的分子机制，结合巧妙的引物设计，发明了一种适用于稀有血型大规模筛查的实验方法，即将一定数量的基因组DNA标本汇集在一起，作为一个模板，在一个PCR-SSP反应中进行检测，再通过两种引物的结合使用对有反应性汇集中的单个标本拆分检测，以进一步分析和判定其基因型。此发明可大大降低筛查工作所需的时间和经济成本，提高筛查效率，相对于经典的血清学更加高效和便捷，可推广应用于实验室及临床Vel血型以及具有类似分子机制的稀有血型的鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法及试剂，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法，包括以下步骤：

1)制备基因组DNA作为随机待检标本；

2)合成Vel-对照品质粒pVel-：选取SMIM1c.64_80纯合缺失突变序列插入载体质粒pUC57-Simple进行合成制得；

3)调节对照品质粒pVel-的使用浓度，使对照品质粒pVel-与随机待检标本所含模板的摩尔数在同一数量级；