[发明专利]一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法在审
| 申请号： | 201810061007.2 | 申请日： | 2018-01-22 |
| 公开（公告）号： | CN108251498A | 公开（公告）日： | 2018-07-06 |
| 发明（设计）人： | 杨加伟;程小玲 | 申请（专利权）人： | 遵义医学院 |
| 主分类号： | C12Q1/26 | 分类号： | C12Q1/26 |
| 代理公司： | 重庆强大凯创专利代理事务所(普通合伙) 50217 | 代理人： | 黄书凯 |
| 地址： | 563000 贵*** | 国省代码： | 贵州;52 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 活性筛选 高通量 氧化酶 生物技术领域 提取上清液 细胞裂解液 显色反应液 羟甲基糠醛 离心收集 诱导培养 培养基 光吸收 活性酶 酶标仪 细胞菌 诱导剂 波长 放入 去除 申请 样本 震荡 筛选 检测 | ||
1.一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、过夜培养：在96孔培养板的孔中均放入100～120μL LB培养基，挑取含5-羟甲基糠醛氧化酶基因的菌株单克隆依次放入孔中，再将96孔培养板放入摇床，在37～40℃的温度下以250～300rmp的转速培养16～20h；
步骤二、诱导培养：向96孔培养板的孔中均加入100～120μL且浓度为0.1～0.5mM IPTG的诱导剂，在16～18℃培养20～24h；
步骤三、离心收集：在5000～6000rmp的转速下离心5～10min，然后收集细胞菌体，去除培养基和诱导剂，加入150～200μL的细胞裂解液，并在20～25℃的温度下以5000～6000rmp的转速震荡1h；
步骤四、二次离心：在5000～6000rmp的转速下离心15～20min；
步骤五、提取上清液与显色反应液：从96孔培养板的每个孔中取20～50μL含5-羟甲基糠醛氧化酶蛋白的上清液置于96孔酶标板中，然后在96孔酶标板中加入含有90～100mM磷酸缓冲液、1～20mM底物和10～20μM 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine与6～10U/mL辣根过氧化物酶的显色反应液；
步骤六、检测：将96孔酶标板放入酶标仪中，在560～580nm波长下测定不同时间的光吸收值。
2.根据权利要求1所述的5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法，其特征在于：步骤一中，所述LB培养基的成分为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L和NaCl 5g/L。
3.根据权利要求2所述的5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法，其特征在于：步骤三中，所述细胞裂解液的成分为：100mM磷酸缓冲液(pH＝6.0～8.0)、1mg/L溶菌酶、10mM氯化镁，1U/mLDNA酶I。
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