[发明专利]一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法

说明书

本申请公开了生物技术领域的一种5‑羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法一，包括以下步骤：过夜培养；诱导培养；离心收集：在5000～6000rmp的转速下离心5～10min，然后收集细胞菌体，去除培养基和诱导剂，加入150～200μL的细胞裂解液，并在20～25℃的温度下以5000～6000rmp的转速震荡1h；二次离心：在5000～6000rmp的转速下离心15～20min；提取上清液与显色反应液；检测：将96孔酶标板放入酶标仪中，在560～580nm波长下测定不同时间的光吸收值。采用本申请就能够快速的从大量样本中筛选出活性酶。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法。

背景技术

呋喃-2,5-二羧酸(FDCA)是一种可代替传统材料用于合成高分子多聚物的新型小分子化合物。呋喃-2,5-二羧酸可由生物来源的5-羟甲基糠醛(HMF)经过3步连续的氧化反应生成。目前研究报道了一种来自甲基菌属Methylovorus sp.strain MP688的5-羟甲基糠醛氧化酶(HMFO)，研究人员以大肠杆菌中重组表达的HMFO为催化剂，成功的将HMF转化成了FDCA，但催化效率较低。由于该酶催化的反应具有重大的应用价值，因此对酶进行改造以提高其催化效率显得尤为重要。定向进化是改进生物酶的常用有效手段，但需要从大量的突变体中筛选出极少数性质提高的突变体，因此要求对突变库进行快速高效的筛选，而常规的HPLC等筛选方法不仅需要昂贵的检测仪器，而且操作步骤多、费时，无法满足对活性酶进行快速定向进化的要求。另外，如若要从自然界中大批量筛选产HMFO野生菌株，常规的筛选方法也不适合。因此，建立一种快速、准确、低成本和易操作的5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量筛选方法是很有必要的。

发明内容

本发明意在提供一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法，以解决使用现有技术不能对活性酶进行快速筛选的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种5-羟甲基糠醛氧化酶的高通量活性筛选方法，包括以下步骤：

步骤一、过夜培养：在96孔培养板的孔中均放入100～120μL LB培养基，挑取含5-羟甲基糠醛氧化酶基因的菌株单克隆依次放入孔中，再将96孔培养板放入摇床，在37～40℃的温度下以250～300rmp的转速培养16～20h；

步骤二、诱导培养：向96孔培养板的孔中均加入100～120μL且浓度为0.1～0.5mMIPTG的诱导剂，在16～18℃培养20～24h；

步骤三、离心收集：在5000～6000rmp的转速下离心5～10min，然后收集细胞菌体，去除培养基和诱导剂，加入150～200μL的细胞裂解液，并在20～25℃的温度下以5000～6000rmp的转速震荡1h；

步骤四、二次离心：在5000～6000rmp的转速下离心15～20min；

步骤五、提取上清液与显色反应液：从96孔培养板的每个孔中取20～50μL含5-羟甲基糠醛氧化酶蛋白的上清液置于96孔酶标板中，然后在96孔酶标板中加入含有90～100mM磷酸缓冲液、1～20mM底物和10～20μM 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine与6～10U/mL辣根过氧化物酶的显色反应液；

步骤六、检测：将96孔酶标板放入酶标仪中，在560～580nm波长下测定不同时间的光吸收值。

优选的，步骤一中，所述LB培养基的成分为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L和NaCl 5g/L。

优选的，步骤三中，所述细胞裂解液的成分为：100mM磷酸缓冲液(pH＝6.0～8.0)、1mg/L溶菌酶、10mM氯化镁，1U/mLDNA酶I。