[发明专利]一种重组人源胶原蛋白的纯化方法

说明书

本发明公开了一种重组人源胶原蛋白的纯化方法，先采用固液分离技术、过滤技术以及超滤技术对大批量的重组人源胶原蛋白进行粗纯，然后用离子交换层析技术进行精纯，所得目标蛋白纯度大于98％，收率大于70％。本发明工艺过程更简单、易操作，对纯化成本要求低，可满足重组人源胶原蛋白工业化生产要求。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组人源胶原蛋白的分离纯化方法。

背景技术

胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的25％～33％，可作为食品添加剂、絮凝剂、乳胶材料、固定化酶载体材料。胶原蛋白是由平行线型链组成，每一线型链由三条扭曲左旋的α-肽链通过链间相互作用紧密结合而形成的一极强的右旋三重螺旋结构。每条α-肽链由多达300个以上的Gly-X-Y三联体重复构成，两端连接具有不同结构的其它小片段。

在现有技术中，生产胶原蛋白传统的也是最主要的方法是利用酸、碱法处理动物来源的组织，为提高胶原蛋白的生物安全性、纯度及活性，拓宽其在化妆品和医疗器械等领域的应用。基因工程技术被广泛应用。国内外一些研究机构及生物公司相继投入研究开发重组人源胶原蛋白，西北大学的范代娣等利用大肠杆菌通过高密度发酵培养生产类人胶原蛋白。中国专利201110327865公开了一种重组人源胶原蛋白及其制备方法，构建了毕赤酵母重组人缘胶原蛋白的基因工程菌，获得了重组人源胶原蛋白。这两种方法都实现了产业化，但在生产过程中，主要的生产成本和工艺难点都在分离纯化阶段。大肠杆菌需要进行菌体收集及破壁，到最后的蛋白复性，毕赤酵母重组人源胶原蛋白分离纯化过程中的发酵液脱色，纯化过程蛋白稳定性等均存在问题。

发明内容

本发明针对现有重组人源胶原蛋白生产存在的问题，提供一种操作简单，所需溶剂少，纯化成本低廉，适合规模化重组人源胶原蛋白纯化的方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、粗分离

将重组人源胶原蛋白发酵液用沉降式离心机进行固液分离，所得上清液用0.2μm中空纤维膜进行过滤，滤出液用截留分子量为6K的超滤膜进行超滤。

2、精细分离纯化

向步骤1超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.1～5.8mS/cm，再用NaOH调节pH至4.5～6.0，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相A与流动相B体积比为95:5的混合液洗脱，最后用流动相A与流动相B体积比为90:10～70:30的混合液洗脱，洗脱流速均为150～250L/min；收集流动相A与流动相B体积比为90:10～70:30时的洗脱液，得到纯度大于98％的重组人源胶原蛋白，其中所述的流动相A是20～50mmol/L pH＝4.5～6.0的柠檬酸缓冲液；流动相B是含1mol/L NaCl的20～50mmol/L pH＝4.5～6.0的柠檬酸缓冲液。

本发明重组人源胶原蛋白的氨基酸数量为411个，分子量为37.2KDa，PI为8.9～9.2，氨基酸序列如下所示：

GPPGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKPGSPGPPGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKPGTPGPPGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKP。