[发明专利]一种定量检测芒果炭疽菌的方法

权利要求书

1.一种定量检测芒果炭疽菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；

步骤二、特异性引物的制备；

步骤三、荧光核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应；

步骤四、采用RealAmp的外侧引物对F3/B3扩增芒果炭疽菌基因组DNA,克隆扩增产物到pMD18-T载体，用于构建RealAmp标准曲线；

步骤五、结果判断；

所述步骤二为：在炭疽菌的ITS1-5.8S-ITS4的保守区间内，利用CgInt/ITS、CaInt2/ITS4引物对扩增序列的重叠区域作为靶标设计出两对特异性引物；所述两对特异性引物包含内侧引物与外侧引物各一对，其中F3和B3为外侧引物，FIP和BIP为内侧引物，所述外侧引物F3为5′-AAGTCGTAACAAGGTCTCC-3′，所述外侧引物B3为5′-CGTTCTTCATCGATGCCAG-3′，所述内侧引物FIP为5′-CCGAAGCAACGGTTAGGTATGTGTAGGTGAACCTGCGGAG-3′，所述内侧引物BIP为5′-CCGCCGGAGGAAACCAAAAACCAAGAGATCCGTTGTT-3′；

所述步骤五为：

定量检测结果的判断：在ESE-Quant Tube Scanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果；

定性检测结果的判断：反应结束后用手甩或者离心将反应管内盖上的SYBR Green I混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性；

定性和定量分析结束后，在RealAmp的反应液中加入Nae I内切酶，37℃酶切3hr后，2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析：可以酶解开的是尖孢炭疽菌，酶解不开的是胶孢炭疽菌，部分酶切产物的则是两个病原菌的混合侵染。

2.根据权利要求1所述的一种定量检测芒果炭疽菌的方法，其特征在于，所述步骤一为：

1)样品在液氮保护下加入PVPP研磨成粉后，加入CTAB缓冲液，涡旋混匀后65±2℃处理30min-60min，颠倒混匀；

2)室温条件下离心取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，涡旋混匀静置分层后离心；如果抽提后界面还不清晰，使用氯仿抽提一次；

3)离心后取上清，加入65±2℃预热的10×CTAB，颠倒混匀后冷却到室温，然后加入无水乙醇，放置不超过1h沉淀DNA；

4)离心，弃上清，加入高盐TE，65±2℃助溶后转入离心管；

5)加入RNase A，37±2℃水浴30-60min后加入等体积氯仿/异戊醇，涡旋后静置分层，离心；

6)取上清，加入等体积氯仿/异戊醇，涡旋，离心；如果抽提后界面还不清晰，使用氯仿抽提一次；

7)取上清，加入NaCl或NaAc，加入无水乙醇，颠倒混匀后放置；

8)离心，用乙醇漂洗后吹干，加适量ddH₂O溶解并调整浓度为0.1-0.5μg/μl，保存备用。