[发明专利]一种定量检测芒果炭疽菌的方法

说明书

本发明公开了一种定量检测芒果炭疽菌的方法，该方法步骤为：对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；特异性引物的制备；RealAmp反应；RealAmp标准曲线的构建；结果判断。本发明方法是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定的优点；本发明可以定量检测芒果炭疽病，并可以区分两种主要病原菌芒果胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌；分析判断反应产物的方法极为简单，适宜于广泛地推广应用。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种定量检测芒果炭疽菌的方法。

背景技术

芒果(Mangifera indica L.)属漆树科芒果属常绿乔木，是热带亚热带地区重要的经济作物，芒果炭疽病是芒果生产中危害最为严重的病害之一，世界范围内通常认为其病原菌为胶孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides(Penz.)Penz.&Sacc.]，又称盘长孢刺盘孢，属于半知菌类炭疽菌属，其有性阶段为子囊菌门小丛壳属围小丛壳菌[Glomerellla cingulate(Stonem.)Spauld et Schrenk]。1979年Fitzell在澳大利亚首次报道尖孢炭疽菌[C.acutatum J.H.Simmonds]也是芒果炭疽病病原菌。在中国，李继勇(1985)首次报道了这2种炭疽菌(Colletotrichum)。芒果炭疽菌的这2种病原菌田间危害症状基本相似，非常不容易区分，其不同的生物学特性以及药剂敏感性差异可能是该病害日益难防治的原因之一。

炭疽菌属真菌常规形态学鉴定方法是以分生孢子和附着胞形态为主，培养特征为辅，以寄主范围为参考的综合特征来鉴别的。然而C.acutatum和C.gloeosporioides均为复合种群，种内的不同类群之间形态差异较大，常规的鉴定常将尖孢误鉴定为胶孢，两者区分起来费时费力且效果不太理想。

炭疽菌属真菌具有潜伏侵染的特性，一旦病菌成功侵染则会给以后的防治工作带来一定的难度，而常规方法只能在病害显症后鉴定，不利于田间病害的识别与防治。为了更好地开展芒果炭疽病的防治工作，应开展该病害的早期快速检测工作，在病害潜伏期便鉴别病菌的种类、评估其危害性、制定防治策略。Mills et al.(1992)设计的胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的特异性检测引物CgInt/ITS4可以扩增获得467bp的特异性PCR条带。随后，Sreeivasaprasad et al.(1996)则设计了尖孢炭疽菌(C.acutatum)的特异性检测引物CaInt2/ITS4可以扩增出490bp的特异性PCR条带。Mills et al.(1992)和Sreeivasaprasad et al.(1996)设计的检测引物均位于rDNA-ITS序列区间内，是基于ITS序列的差异性进行的特异性检测分析。为此，我们也利用ITS1/ITS4以及CgInt/CaInt2之间的序列相关性开展相关的多重巢式PCR检测，应用这两个特异性的引物可以检测并区分C.acutatum和C.gloeosporioides两种病原菌(张贺等,2013,热带作物学报)。

近年来，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR检测技术需要特殊的仪器设备且检测成本较高，而且它的检测时间也还是比较长(2～3小时)，不适合田间大规模的快速应用。因此，在加强芒果炭疽菌的病原菌检测监测中，有效地开展田间炭疽病菌的检测，辨别危害芒果的优势炭疽菌种，针对性地采取有效防治措施，减少经济损失，迫切需要开发一种灵敏度高、操作简便、成本低廉且结果判断迅速的检测方法，在一定程度上可以取代PCR的检测方法。