[发明专利]一种细胞接种及挑选细胞单克隆的方法、应用

说明书

本发明属于细胞克隆技术领域，具体涉及一种细胞接种及挑选细胞单克隆的方法、应用。细胞接种时在超净工作台中水平静置20‑30min，然后直接水平移入二氧化碳培养箱培养，这样可以达到细胞种板均匀，成功率可接近100％；在挑选细胞单克隆时，不适用玻璃克隆环，而是使牛津杯环状的底部沾满一层封闭液，将牛津杯放在选定的克隆之上，不会导致漏液的发生。

技术领域

本发明属于细胞克隆技术领域，具体涉及一种细胞接种及挑选细胞单克隆的方法及其应用。

背景技术

细胞生物学实验中经常需要给细胞传代或种细胞而进行某项实验，细胞传代或种细胞过程涉中及到细胞接种和挑选细胞单克隆两个重要步骤。其中，细胞接种的常规方法是在细胞种入孔板后，用手将孔板平拿起，左右及前后晃动几下，然后在显微镜下观察，此种方法会导致孔板中的细胞分布不均匀，如果细胞分布不均匀将直接对后续siRNA、miRNA等转染、加药处理等实验结果产生影响，这样就很难评价干预因素对细胞的作用。

挑选细胞单克隆常用的简单易行的方法是玻璃克隆环，这种玻璃克隆环在应用时，首先将玻璃克隆环灭菌，用无菌硅脂实现玻璃克隆环的密封，然后用胰酶消化，以获取细胞单克隆。但是由于玻璃克隆环较轻，在挑选时，可能会导致克隆环底部无菌硅脂密封不紧而漏液，如果用镊子稍用力按压可能导致克隆环的移动，致使其不能完全圈住单克隆细胞等，以上原因往往导致单克隆挑选的失败或者单克隆之间出现交叉污染的情况，最终导致实验失败。

综上，现有技术存在的问题是，细胞接种过程孔板中的细胞分布不均匀和挑选细胞单克隆过程中由于玻璃克隆环较轻，导致克隆环底部无菌硅脂密封不紧而漏液，从而导致后续实验无法正常进行。

发明内容

本发明提供的一种细胞接种及挑选细胞单克隆的方法及应用，使得细胞接种过程孔板中的细胞分布均匀和挑选细胞单克隆过程中避免漏液，从而保证后续实验正常进行。

本发明的目的是提供一种细胞接种及挑选细胞单克隆的方法，包括以下步骤：包括细胞接种和挑选细胞单克隆，其中细胞接种包括以下步骤：

步骤(1)，选取对数生长期的细胞，消化细胞，计数并稀释，得到细胞悬液；

步骤(2)，在孔板中均加入培养基，晃动孔板至培养基浸润整个孔底，然后移除培养基，水平放置孔板；

步骤(3)，混匀步骤(1)中的细胞悬液，在步骤(2)孔板的孔内加入细胞悬液，静置20-30min；

步骤(4)，孔板经步骤(3)的静置后保持水平状态并移入二氧化碳培养箱培养，培养后细胞即能够均匀分布于孔板内；

步骤(5)，将步骤(4)中孔板孔内的细胞进行细胞转染，培养，直到有细胞单克隆的出现，用于挑选细胞单克隆；

所述挑选细胞单克隆包括以下步骤：

步骤A，选择步骤(5)中符合要求的细胞单克隆，进行标记；

步骤B，移除步骤(5)中培养板内的培养液，用PBS缓冲液冲洗培养板，并移除悬浮起来的细胞；

步骤C，将牛津杯底部粘附上封闭液；然后将牛津杯放在选定的细胞单克隆之上，垂直放下，圈住细胞单克隆；

步骤D，加0.25g/100ml胰酶到牛津杯里；室温下孵育1-5min；加培养基至到牛津杯中使细胞悬浮，然后将悬浮的细胞转移，完成细胞单克隆的挑选。

优选的，上述细胞接种及挑选细胞单克隆的方法中，步骤(1)中采用0.25g/100ml胰酶消化细胞。

优选的，上述细胞接种及挑选细胞单克隆的方法中，步骤(2)中所述孔板为6孔板、12孔板或24孔板。