[发明专利]一种子宫内膜干细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)采集经血样本；

2)子宫内膜干细胞的分离：取100-200重量份的步骤1)采集的经血样本，与20-40重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，放置于多功能振荡器上振摇20-30min，加入淋巴细胞分离液，离心，得到四层分离液，吸出底层分离液，即得A液，去除顶层透明液体，再加入1-2重量份的HES和1.5-2.5重量份的消化酶混合均匀，将混合液倒入离心管中，将离心管放置于离心机中离心6-8min，弃上清，取沉淀，即得B液，将A液和B液用同体积的PBS缓冲液洗涤，过200μm细胞筛网，收集子宫内膜干细胞；

3)子宫内膜干细胞的原代培养：将步骤2)分离得到的子宫内膜干细胞进行原代培养，得原代培养细胞。

2.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤3)具体包括以下步骤：

3)子宫内膜干细胞的培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO₂的饱和湿度的培养箱中，培养的前两天每天向培养基中添加浓度为2％-5％的海藻糖、5％-10％的腺嘌呤和5％-10％的酪氨酸，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括2％-5％的甘露醇、10％-14％的氯化镁、2％-5％的SOD和1％-2％的NAC的MEM培养基。

3.如权利要求2所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤3)所述的原代培养方法为：将步骤2)制得的子宫内膜干细胞接种于原代培养基上，将原代培养基放置于光照强度为5000-8000lx的条件下照射5-10min，再将培养基放置于培养箱中培养；其中，原代培养基在光照照射前添加浓度为10-20ng/mL的生育酚琥珀酸单酯、5-15ng/mL的聚乳酸、20-40ng/mL的肝素和12-16ng/mL的唑菌胺酯。

4.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：

4)细胞传代培养：将原代培养得到的原代培养细胞接种于传代培养基上进行传代培养，其中，传代培养方法为：将传代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO₂的饱和湿度的培养箱中，培养6-7天后，更换培养基，弃除未贴壁细胞，培养至第5代后，每天向传代培养基中加入20-40重量份的增活剂，待细胞生长达到90-95％融合时用质量浓度为3％的胰蛋白酶消化收集细胞，即得传代培养细胞。

5.如权利要求4所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述增活剂由以下重量份的组分组成：5-10的D-半乳糖、1-2的NGF、2-5的维生素C、2-5的HEPES、5-8的罂粟碱和5-10的氯化钠。

6.如权利要求1所述子宫内膜干细胞的分离培养方法，所述多功能振荡器的震荡速度为30-50r/min，所述离心机的离心速度为1000-1500r/min。

7.如权利要求4所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：

5)冻存：用2-5℃的冻存液重悬步骤4)获得的传代培养细胞，使细胞的密度为1-2×10⁷/ml，放入冻存盒中采用程序降温，最后转入-196℃液氮保存。

8.如权利要求7所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，所述程序降温包括如下步骤：4℃0.5-1h，-10℃1-2h，-30℃0.5-1h，-80℃12h。