[发明专利]一种子宫内膜干细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种子宫内膜干细胞的分离培养方法。

背景技术

人类子宫内膜功能层在月经周期手提内激素的作用发生周期性的增生和脱落，早年即有学者提出子宫内膜显著的增生能力可能源于子宫内膜干细胞的存在，大量的临床观察和基础研究均显示，子宫内膜干细胞可能成为子宫内膜过薄和内膜病变患者进行内膜修复替代治疗的手段，同时可为内膜异位症、子宫内膜癌等提供新的研究思路；子宫作为人体中具有超强再生能力的器官，其子宫内膜在么个月经周期中会增长约5-7cm，而以这种增长速率，子宫内膜会在妇女育龄期经过500次左右有规律的脱落和再生过程，同时，经血的获得不具有侵入性，不会对供者造成伤害，来源广泛，且对其研究不会涉及伦理道德和法律问题，此外，还具有采集方便等特性，因此成为寻找子宫内膜干细胞的新来源及提高临床应用效果的研究热点。

使用常规手段分离经血内的子宫内膜干细胞主要存在以下问题：1分离液使用量大，离心后部分红细胞仍然悬浮在分离液中，致使收集到的细胞中混杂较多的红细胞，制得的子宫内膜干细胞纯度差；2.红细胞层内也混杂有子宫内膜干细胞，致使细胞收率较低；3.较长时间的离心对细胞的活性造成损伤；4.经血样本向本外周血样本较为复杂，存在较多粘液物质及大量血凝块，杂质较多；5.子宫内膜干细胞使用培养基成分较多，价格昂贵，且体外培养10代以上，细胞容易出现衰老、退化的现象，增殖效率低，且在培养基中添加较多的细胞生长因子，会促进干细胞分化，对于维持其感性与稳定性不利，影响干细胞储存于研究质量。

发明内容

针对以上人子宫内膜干细胞分离过程中存在的大量问题，本发明提供了一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，该方法分离培养的子宫内膜干细胞纯度高，传代培养15代后细胞活率依然高达94.5％，同时，该方法培养得到的子宫内膜干细胞污染率低，多次传代后的干细胞具有多向分化的潜能。

本发明具体技术方案如下：

一种子宫内膜干细胞分离培养方法，该方法包括以下步骤：

1)采集经血样本；

2)子宫内膜干细胞的分离：取100-200重量份的步骤1)采集的经血样本，与20-40重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，放置于多功能振荡器上振摇20-30min，加入淋巴细胞分离液，离心，得到四层分离液，吸出底层分离液，即得A液，去除顶层透明液体，再加入1-2重量份的HES和1.5-2.5重量份的消化酶混合均匀，将混合液倒入离心管中，将离心管放置于离心机中离心6-8min，弃上清，取沉淀，即得B液，将A液和B液用同体积的PBS缓冲液洗涤，过200μm细胞筛网，收集子宫内膜干细胞；

3)子宫内膜干细胞的原代培养：将步骤2)分离得到的子宫内膜干细胞进行原代培养，得原代培养细胞。

其中，HES为羟乙基淀粉，消化酶为任意一种消化酶，如胃蛋白酶等。

进一步改进，步骤3)具体包括以下步骤：

3)子宫内膜干细胞的培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO₂的饱和湿度的培养箱中，培养的前两天每天向培养基中添加浓度为2％-5％的海藻糖、5％-10％的腺嘌呤和5％-10％的酪氨酸，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括2％-5％的甘露醇、10％-14％的氯化镁、2％-5％的SOD和1％-2％的NAC的MEM培养基。