[发明专利]自多潜能干细胞有效诱导定形内胚层

说明书

本发明涉及使多潜能干细胞分化为原条细胞群的方法，以逐步方式用于进一步成熟为定形内胚层。

本申请是与母案发明名称相同的分案申请，母案的中国申请号是201280040881.9，国际申请号是PCT/EP2012/062013，申请日是2012年6月21日。

技术领域

本发明涉及使多潜能干细胞分化为原条细胞群的方法，以逐步方式用于进一步成熟为定形内胚层。

背景技术

胰岛的移植对改进1型糖尿病的治疗有着巨大前景，但是缺乏可利用的供体胰岛是需要解决的一个障碍。多潜能干细胞原则上可以产生无限数量的移植用β细胞，但迄今没有找到产生全功能β细胞的可靠方案。前肠衍生器官：胰、肺、甲状腺、肝、食道和胃起源于定形内胚层(DE)，其为原肠胚形成期间形成的三个胚层之一。DE的诱导是自内胚层衍生组织向分化细胞类型(例如产生胰岛素的胰β细胞)形成的第一个关键步骤。已针对小鼠和人这二者报告了由多潜能胚胎干(ES)细胞形成DE细胞，载于例如WO2005/116073、WO2005/063971和US 2006/0148081。由DE细胞产生胰内胚层(PE)细胞对于产生用于治疗糖尿病的产生胰岛素的β细胞而言是必要的。

已知胚胎中的DE形成经过原条(PS)形成(中内胚层中间体)的中间步骤，所述原条具有形成中胚层或者DE的潜力。在细胞水平上，所有发育过程最终都由不同的信号转导途径的协同作用来控制。这其中，Wnt信号转导对于协调整个发育过程中发生的复杂细胞行为而言是必不可少。Wnt信号转导控制细胞增殖、干细胞维护和细胞命运的决定以及有组织的细胞运动和组织极性的建立。它还在人类癌症中被频繁地解除控制并且涉及退行性疾病。作为治疗干预的潜在靶标，它因此给干细胞生物学和再生医学领域带来新的希望。

通过与或不与Wnt组合使用激活素A/Nodal，已经描述了DE的诱导。具体地讲，先前已经报道了Wnt受体配体Wnt3a当在5天AA-介导的DE诱导的第1天期间(24 h)与激活素A(AA)孵育时，即，使用常规D'Amour方案(Kroon等人2008, Nat Biotech, 2006)，促进有效的DE形成。

将各Wnt蛋白按其可指定的特定活性分类的试图，已经形成了将Wnt分为“标准的(canonical)”或“非标准的(non-canonical)”的细分类，其根据前者(而非后者)的诱导β-连环蛋白/TCF信号转导的能力。

CHIR是一种糖原合酶激酶3 β (Gsk3b)抑制剂和使小鼠胚胎干细胞维持在多潜能状态的限定组织培养基的一种已知成分(Ying等人Nature 453, 519-523)。Gsk3b具有多个靶标，但主要是已知能调节β-连环蛋白的降解和/或核转移。使用其它糖原合酶激酶3 β(Gsk3b)抑制剂例如BIO和Wnt3a，已经描述了稳定的β-连环蛋白在自人胚胎干细胞(hESC)向PS形成中的作用。然而CHIR是迄今为止所报道的最具选择性的Gsk3b-抑制剂。

AA和CHIR的共孵育降低了DE形成的稳定性，导致有效性较差和稳健性较差的方案。本发明涉及与用常规诱导方案获取DE (D’Amour方案，描述于Kroon等人，2008)相比，在AA-介导的定形内胚层诱导之前利用限定浓度范围的CHIR而无AA来处理多潜能干细胞。这种先暴露给CHIR、再暴露给AA的序贯暴露是必不可少的并且反映了依次的PS形成(由CHIR诱导)，然后是通过AA的更有效和快速的DE形成。本发明涉及首先对PS、然后对DE的不连续的和依次的诱导控制，导致总体更有效，具有较早的SOX17表达峰和稳健的DE方案。用Wnt3a处理不能重现CHIR的这些效应。

附图说明

D0: 在任何处理之前的未分化细胞

Ctrl: 无Chir处理D1。细胞在起始期间留在RPMI中，然后经过AA D2替换和从D3开始的AA +血清替换(B27)。