[发明专利]一种新型酿酒酵母表达体系及其构建方法

说明书

本发明利用RNA聚合酶I在rDNA基因转录方面的高效作用，用rDNA基因启动子启动外源或内源基因表达，构建了一种新型酿酒酵母表达体系。一种酿酒酵母新型表达体系及其构建方法，包括一种新型表达载体，所述载体从5’到3’依次包括YEplac195质粒骨架、外源基因表达盒、筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括rDNA启动子、内部核糖体进入位点（Internal ribosome entry site，IRES）序列、外源基因表达框、poly(T)序列、rDNA终止子；所述筛选标记基因表达盒包括启动子、筛选标记基因、转录终止子。本发明的表达系统可实现外源基因在酿酒酵母中的高效表达，对酿酒酵母产品开发及基础理论研究具有重要的意义，同时对于酿酒酵母中RNA聚合酶I介导的调控机制和rRNA合成机制的研究也具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种新型酿酒酵母表达体系及其构建方法。

背景技术

随着基因组学研究的迅速发展，如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等多种表达体系应运而生，以满足挖掘新基因及其新功能，构建新型工程菌等的迫切需求。酵母表达体系有很多，如酿酒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母和产朊假丝酵母等，其中酿酒酵母和毕赤酵母是最常用的两种表达系统。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），又称面包酵母，长期应用于酿酒、面包和馒头制作等，安全可靠，不产生毒素，是国际公认的食品安全级（Generally Regarded AsSafe，GRAS）真核微生物；由于其菌体细胞富含营养，具很高的经济价值，酵母抽提物或酵母浸出物（Yeast Extract）不仅广泛用于微生物、动植物细胞培养，在制药、酿造及发酵食品中有着举足轻重的作用，而且也直接用于饲料及食品添加剂；由于酵母在工业生产中具有良好的发酵性能，在发酵过程中能够快速分裂，容易培养，对杂菌污染具有较强的抗性，遗传背景清晰，基因操作简单等优势，使其在基因工程技术中常被用于代谢工程改造的出发菌株；在新近推崇的合成生物学研究中，酿酒酵母因其特殊的代谢能力等特点已成为备受关注的底盘细胞，可用于不同作用微生物细胞工厂的构建；相较于原核生物，能识别真核基因帮助其进行转录翻译后修饰，表达蛋白接近天然构象，并且可以将外源蛋白分泌至胞外，有利于表达产物纯化；作为模式物种之一，有许多涉及人类遗传性疾病的基因均与酵母基因具有很高的同源性，所以酵母还可以作为高等真核生物特别是人类基因组研究的模式生物，以提高基因诊断和治疗水平；以酿酒酵母为代表的酵母表达体系已成为生产生物基化学品、表达新型外源基因，服务于工农业和医药领域的重要工具。

通常情况下，酿酒酵母与其他真核生物一样，至少产生三种主要的RNA，包括核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）和信使RNA（mRNA），其中，rRNA是由RNA聚合酶I负责合成的，表达编码的蛋白质是由RNA聚合酶II负责合成的，tRNA和5S rRNA则是由RNA聚合酶III负责合成的。外源基因在酵母中的表达效率与启动子强度、RNA聚合酶II调控的mRNA的转录效率等因素有关，目前使用的酿酒酵母表达体系因缺乏强有力的启动子，及受到其他方面因素的影响，利用酿酒酵母发酵生产时，高水平表达外源基因尚有难度。