[发明专利]质谱法检测甲型流感病毒H5N1多重PCR产物的方法及其产品

说明书

本发明提供一种通过质谱法直接检测甲型流感病毒的多重PCR产物的方法，包括使用特定引物对病毒DNA进行多重PCR扩增，并通过MALDI‐TOF MS检测多重PCR产物的片段的大小。该方法可检测选自H5N1亚型甲型流感病毒。本发明还保护相关检测产品。本发明方法将多重PCR和MALDI‐TOF MS相结合用于临床病原微生物鉴定，不仅快速、简便，还易观察、直观、准确性高。

技术领域

本发明属于分子生物学检测的技术领域，涉及一种利用质谱特征峰图检测多重PCR产物的方法及其产品。本发明还涉及使用多重PCR扩增技术检测甲型流感的引物组和试剂盒。

背景技术

流行性感冒简称“流感”，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，具有突然爆发、迅速蔓延、波及面广的特点，主要通过咳嗽和打喷嚏传播。流感在人类历史上已存在很长时间，早在1580年就有了全球性流感记录。20世纪共爆发过四次：1918-1920年的西班牙流感(H1N1)，1957年的亚洲流感(H2N2)，1968年的我国香港地区流感(H3N2)和1977年的俄罗斯流感(H1N1再次爆发)。我国在近半个世纪以来(1953年至今)，共发生大中小规模的流感17次，其中2次为大流行。

引起流感的病毒是单链核糖核酸病毒，有球形及多形性，直径约80-100nm。也有细丝状的，直径可能就几微米大小。根据其核蛋白(NP)和基质蛋白(M)抗原性的不同被分为甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒具有很强的变异性，是引起人类、家畜及禽类流感流行的主要病毒。

甲型流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属，为有包膜分节段的单负链RNA病毒。其基因组由8个单股负链RNA片段组成，每个基因在3′末端和5′末端都带有12-13个保守核苷酸序列。这8个片段可编码10种蛋白，其中，8个蛋白(HA、NA、PB1、PB2、NP、M1、M2和PA)为结构蛋白，NS1和NS2为非结构蛋白，位于宿主细胞的胞质中。根据HA和NA抗原性的差异，甲型流感病毒可分为若干亚型，迄今已发现有18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。任何一对HA和NA均可组合成一个亚型，如H1N1、H3N2、H5N1和H7N9等。

甲型流感病毒能产生低保真RNA聚合酶。低保真RNA聚合酶可引起流感病毒的高突变率以及基因重组，可使流感病毒呈现分子多样性，使每个病毒亚型可进化为多个分支。甲型H1N1流感病毒由经典猪流感病毒、人H3N2型流感病毒、北美禽流感病毒在20世纪90年代后期经过“三重配”后再与北美猪群中流行的H3N2和H1N2猪流感病毒及Eurasia avian-like猪流感病毒重配后而产生，HA和NA抗原的持续变异是引起病毒流行的主要原因。同样地，在家禽市场中，H5N2也会出现持续的重组变异。2012年在西藏的鸡群中就分离到一株天然的H9N2和H5N1重组的H5N2亚型流感病毒。近期报道表明，对水禽长期使用某种药物会导致H5N2亚型流感病毒发生突变进而更易于感染人类。而2013年3月底在上海发现的新型禽流感H7N9病毒是由5个病毒经过4次重组产生，产生两个主要流行株A和B型。即由野鸟H7N9(NA节段)、浙江的H7N3病毒(HA节段)及北京、江苏、上海浙江的家禽H9N2病毒(除HA和NA节段外)重组而产生。由于RNA聚合酶缺乏校正和修复功能，每个核苷酸在复制周期中突变率极高。另外，流感病毒宿主种类繁多，而且分段基因组复制周期短，感染频率高，因此在复制过程中极易发生变异，产生新毒株或新的亚型变种，这种情况在甲型性流感病毒中表现最为突出。并且，这种快速而持续的变异，使得机体免疫系统不能对流感病毒产生长期的免疫力，从而导致流感的反复流行和难以控制。

流感的确诊需要实验室检查证实，目前较为常见的检测方法有病毒分离培养、病毒核酸检测、血清学检测、病毒抗原检测、基因芯片技术等。快速检测方法包括酶联免疫法(ELISA)、流感抗原快速检测试剂盒等、直接和间接免疫荧光法、基于PCR的方法、测序法、寡核苷酸微阵列芯片法和核酸扩增产物质谱检测法等。