[发明专利]猪α肠道冠状病毒及其培养方法和应用

说明书

本发明涉及微生物病毒领域，具体涉及猪α肠道冠状病毒及其培养方法和应用。本发明的猪α肠道冠状病毒核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了优化后的猪α肠道冠状病毒分离培养方法，优化了敏感细胞系和培养条件，让病毒更好的适应体外细胞，可使用病样样品直接接种Vero细胞；同时使病毒滴度明显提高，对猪α肠道冠状病毒后续的研究和工业化利用提供了更好基础条件。

技术领域

本发明涉及微生物病毒领域，具体涉及猪α肠道冠状病毒及其培养方法和应用。

背景技术

引起猪腹泻的猪冠状病毒病主要有猪传染性胃肠炎(TGEV)和猪流行性腹泻(PEDV)。不同年龄和不同品种的猪均易感，但对哺乳仔猪的危害最为严重，以水泻、呕吐和脱水为主要症状。2010年入冬以来，猪流行性腹泻病毒变异株开始在我国流行，并导致全国范围内的严重爆发，初生仔猪感染后死亡率达90％以上；随后，可导致仔猪腹泻的新型肠道冠状病毒Delta冠状病毒(PDCoV)也被发现；冠状病毒的高变异特性目前已经成为仔猪腹泻防控的难点，给养猪业造成巨大经济损失，对养猪业的发展形成严重威胁。

2017年初，广东部分猪场先后发生以新生仔猪严重腹泻、呕吐和脱水为主要特征的高度接触性传染病，主要表现为哺乳仔猪高发病率和高死亡率。技术人员通过实验室检测排除了常见猪腹泻相关病原感染，怀疑有新病毒株感染，亟待进一步鉴定和制定防治方案。

发明内容

鉴于此，本发明通过收集临床病料，筛选敏感细胞系、优化培养条件，成功分离到一株病毒，对分离的病毒进行生物学特性研究、分子进化分析及动物回归试验确证了此次引发个别猪场发生腹泻的病原是一种新型的猪肠道冠状病毒。通过全基因序列分析发现其同源性与蝙蝠α冠状病毒同源性最高，因此将其命名为猪α肠道冠状病毒 (Swine entericalphacoronavirus SeACoV)。本发明还通过建立 SeACoV体外培养条件，对分离到的病毒进行鉴定，此毒株的成功分离鉴定为该病的防控提供了突破口，为后续研究奠定了基础，其结果具有重要意义。

本发明技术方案如下：

一种猪α肠道冠状病毒SeACoV-GD02/2017,保藏号：CCTCC NO:V201801；保藏日期：2017年12月24日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉，武汉大学；其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述猪α肠道冠状病毒与蝙蝠肠道阿尔法冠状病毒 HKU2在全基因组核酸水平上的同源性为94.9％；与马铁菊头蝠阿尔法冠状病毒YN2012在全基因组核酸水平上的同源性为88.3％。

一种猪α肠道冠状病毒的分离培养方法，包括步骤：

(1)病料采集与处理；

(2)将步骤(1)中所得到病料进行传代培养；

(3)对步骤(2)培养所得产物进行筛选检测。

进一步的，所述步骤(2)传代培养时，采用Vero细胞，配合含胰蛋白酶的维持液。

进一步的，所述步骤(2)传代培养操作方法包括：将病料直接接种于经含胰蛋白酶的DMEM洗过的Vero细胞；在37℃的5％CO₂条件下于含胰蛋白酶的吸附液中吸附；然后再于含胰蛋白酶的维持液中培养；重复上述操作进行传代培养。

进一步的，所述步骤(2)中胰蛋白酶的终浓度为6μg/mL。

进一步的，所述步骤(2)传代培养时，每次传代前，将上一代的细胞培养物反复冻融3次。

进一步的，所述猪α肠道冠状病毒在制备猪α肠道冠状病毒病的诊断试剂中的应用。

进一步的，所述猪α肠道冠状病毒在制备预防猪α肠道冠状病毒病的疫苗中的应用。

本发明有益效果：