[发明专利]一种制备酰基-酰基载体蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种制备酰基‑酰基载体蛋白的方法。以脂肪酸盐和酰基载体蛋白为底物，使用添加MgCl₂，Li₂SO4，三磷酸腺苷，二硫苏糖醇的Tris‑HCl缓冲液，以来源于Vibrio harveyi的脂酰‑ACP合成酶催化下，制备C4‑C18链长酰基‑酰基载体蛋白，尤其突破了长链酰基‑酰基载体蛋白规模制备产率低的瓶颈，实现了高转化率的长链(C16‑C18)酰基‑酰基载体蛋白的规模化合成。本发明所合成的酰基‑酰基载体蛋白可作为多种酶的反应底物，在生物工程领域具有显著的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域中的酰基-酰基载体蛋白制备，涉及在体外高效规模化制备C4-C18链长酰基-酰基载体蛋白。

背景技术

酰基载体蛋白(acyl carrier protein，ACP)在生物体内负责将酰基转移至目标底物形成酰基化物，是脂肪酸、磷脂、聚酮类抗生素、类脂A等生物合成途径中酰基的重要载体。基因acp的表达产物即apo-ACP，通常由70-80个氨基酸残基构成，含有一个高度保守丝氨酸(Ser)结构域(D-S-L)。Apo-ACP中Ser残基的羟基通过磷脂键连接来自辅酶A的4’-磷酸泛酰巯基乙胺基团后，成为活性ACP形式即holo-ACP。脂酰基通过硫酯键与holo-ACP中磷酸泛酰巯基乙胺末端巯基结合形成acyl-ACP。

Acyl-ACP是生物代谢过程多种酶的必须底物，且体内游离的acyl-ACP很少，很难直接分离得到特定链长的acyl-ACP。且没有体外大规模合成与生产ACP的方法。因此，在体外合成acyl-ACP不仅对研究相关酶的催化机制具有重大意义，高效稳定合成不同链长acyl-ACP兼具潜在的商品开发价值。

Acyl-ACP体外合成以holo-ACP和脂肪酸为底物，由脂酰-ACP合成酶(acyl-ACPsynthetase，AaaS，汪玲玲等，大肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成，微生物学报，2008，48(7)：963～969)催化完成。其中，脂酰-ACP合成酶的来源、脂肪酸的链长及饱和度、ATP的浓度、金属离子的添加浓度以及acyl-ACP的定量检测为acyl-ACP合成的关键要素。

1979年，Charles 0.Rock和John E.Cronan报道了一种利用Escherichia coli来源脂酰-ACP合成酶(Rock CO,Cronan JE.Solubilization,Purification,and SaltActivation of Acyl-Acyl Carrier Protein Synthetase from Escherichia coli，JBiol Chem,1979,254(15):7116-7122)，通过¹⁴C标记C16:0,在Tris-HCl(0.1M,pH 8.0),ATP(5mM),MgC1₂(10mM),LiCl(0.4M),Triton X-100(2％),ACP(15μM),DTT(2mM),及AaaS(0to10mU)条件下，在40μL反应体系下合成¹⁴C16-ACP的方法。该方法反应体系微量，且未对产物的合成产率进行评价。

1990年，Byers DM和Holmes CG报道了一种利用Vibrio harveyi来源的脂酰-ACP合成酶(Byers DM,Holmes CG.A soluble fatty acyl-acyl carrier proteinsynthetase from the bioluminescent bacterium Vibrio harveyi.Biochemistry andCell Biology,1990,68:1045-1051)，在Tris-HCl(0.09M,pH 7.8)，MgSO₄(10mM)，ATP(10mM)，DTT(5mM)，³H标记豆蔻酸(80μM)在50μL反应体系下合成C14-ACP的方法。该方法反应体系微量，且未对产物的合成产率进行评价。