[发明专利]一种小公鱼免疫调节肽的制备方法

权利要求书

1.一种小公鱼免疫调节肽的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括：选取原料小公鱼进行酶解获得小公鱼蛋白肽，将获得的小公鱼蛋白肽作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，通过分离纯化获得小公鱼免疫调节肽产品。

2.根据权利要求1所述的小公鱼免疫调节肽的制备方法，其特征在于所述的选取原料小公鱼进行酶解获得小公鱼蛋白肽是：

a）将原料小公鱼清洗后捣碎制成浆料，

b）酶解：选用蛋白酶对小公鱼浆料进行酶解，制成酶解液；

c）超滤：将酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液；

d）将酶解液用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行凝胶柱层析和缓冲液洗脱，分别收集各峰后，将其作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，获得相应的具有生物活性的峰，再用反相高效液相色谱(RT- HPLC)纯化；

e）经过反相高效液相色谱(RT- HPLC)纯化及氨基酸序列检测，获得小公鱼免疫调节肽。

3.根据权利要求2所述的小公鱼免疫调节肽的制备方法，其特征在于：

所述的步骤b）中，蛋白酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜蛋白酶，最佳酶解温度为42℃、pH值为2、料液比为1:8—12 g/mL、时间为6—10 h、加酶量为1500—1600 u/g；

所述的步骤d）中，所述的凝胶柱层析和缓冲液洗脱是：PH8.5Tris-HC1 缓冲液，0 ～0.03mol/NaCl 梯度洗脱，收集有活性的各峰，冻干后，凝胶柱脱盐；

所述的巨噬细胞来源于动物的外周血、骨髓、组织，或经体外诱导分化获得；

所述的步骤e）中，所述反相高效液相色谱，即用RT-HPLC进行纯化，其色谱条件是:

1)样品前处理:将样品用0.06%TFA的水溶解到0.6ml，离心12000-14000RPM，离心10分钟后取上清；

2)系统: Agilent 1260 HPLC；

3)柱子:ZorbaxSB-C18 4.6X250 5um；

4)进样体积:80-100ul；

5)缓冲液、平衡缓冲液: 0.06%TFA洗脱缓冲液: 0.05%TFA的乙腈；

6) 梯度:0%–0 % B洗脱4分钟，0%–8% B洗脱25分钟，8%-100%B洗脱1分钟，100% -100%B洗脱5分钟；

7)流速:1.0 ml/min；8）检测:280nm/214nm。

4.根据权利要求3所述的小公鱼免疫调节肽的制备方法，其特征在于：

所述的步骤d）中，所述的体外诱导分化是：将单个核细胞用添加有浓度为10—100μg/mL细胞因子的RPMI1604或TCM199完全培养液在36—38℃下培养1—10天，得到巨噬细胞；所述细胞因子为GM—CSF、M—CSF、IL—4和IL—6中的一种或几种。