[发明专利]一种小公鱼免疫调节肽的制备方法

说明书

一种小公鱼免疫调节肽的制备方法，所述的制备方法包括：选取原料小公鱼进行酶解获得小公鱼蛋白肽，将获得的小公鱼蛋白肽作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，通过分离纯化获得小公鱼免疫调节肽产品，通过酶解获得小公鱼蛋白肽是：a）将原料小公鱼清洗后捣碎制成浆料，b）酶解：选用蛋白酶对小公鱼浆料进行酶解，制成酶解液；c）超滤：将酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集>10KD、10‑5KD、5‑3KD和<3KD分子量的酶解液；d）将酶解液用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行凝胶柱层析和缓冲液洗脱，分别收集各峰后，将其作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，获得相应的具有生物活性的峰，再用反相高效液相色谱纯化；e）经过反相高效液相色谱(纯化及氨基酸序列检测，获得小公鱼免疫调节肽。

技术领域

本发明涉及的是一种小公鱼免疫调节肽的制备方法，属于免疫类生物制品技术领域。

背景技术

免疫系统是人体进行自我防卫的重要系统。病原体等有害物质进入体内后，免疫系统便自动进行免疫调节，通过识别、阻挡或吞噬抗原，维护人体内环境的稳定。然而非正常的免疫调节也会对人体造成一定的伤害，如免疫缺陷病、自身免疫疾病、超敏反应等。目前，由免疫力低下导致的癌症、肿瘤疾病正处于高发阶段。然而陆地资源不断减少以及海洋探索技术日异月新的发展，使得海洋生物资源的应用与开发越来越受到关注。海洋广阔的地域和复杂的环境因素造就了海洋生物的多样性和特殊性。近年来，我国的研究学者从海洋生物中提取生物活性肽对免疫调节功能进行了大量的研究。

小公鱼属于鳀科鱼类，为短生命周期和短食物链的鱼类，生长迅速，具有较高的经济价值，是食用动物蛋白的来源之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种通过酶解获得蛋白肽，且酶解反应条件温和、反应时间短、效率高，反应过程易控制，蛋白肽得率高，对免疫调节功能作用明显的小公鱼免疫调节肽的制备方法。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种小公鱼免疫调节肽的制备方法，所述的制备方法包括：选取原料小公鱼进行酶解获得小公鱼蛋白肽，将获得的小公鱼蛋白肽作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，通过分离纯化获得小公鱼免疫调节肽产品。

作为优选：所述的选取原料小公鱼进行酶解获得小公鱼蛋白肽是：

a）将原料小公鱼清洗后捣碎制成浆料，

b）酶解：选用蛋白酶对小公鱼浆料进行酶解，制成酶解液；

c）超滤：将酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集&gt;10KD、10-5KD、5-3KD和&lt;3KD分子量的酶解液；

d）将酶解液用葡聚糖凝胶Sephadex G25进行凝胶柱层析和缓冲液洗脱，分别收集各峰后，将其作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，获得相应的具有生物活性的峰，再用反相高效液相色谱(RT- HPLC)纯化；

e）经过反相高效液相色谱(RT- HPLC)纯化及氨基酸序列检测，获得小公鱼免疫调节肽。

作为优选：所述的步骤b）中，蛋白酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜蛋白酶，最佳酶解温度为42℃、pH值为2、料液比为1:8—12 g/mL、时间为6—10 h、加酶量为1500—1600 u/g；

所述的步骤d）中，所述的凝胶柱层析和缓冲液洗脱是：PH8.5Tris-HC1 缓冲液，0 ～0.03mol/NaCl 梯度洗脱，收集有活性的各峰，冻干后，凝胶柱脱盐；

所述的巨噬细胞来源于动物的外周血、骨髓、组织，或经体外诱导分化获得；

所述的步骤e）中，所述反相高效液相色谱，即用RT-HPLC进行纯化，其色谱条件是: