[发明专利]一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶，其特征在于：重组纤维素酶为产纤维四糖的持续性内切纤维素酶CcCel9A中在H123A、R374A或H372A/Y415A位点突变所得突变体；

所述持续性内切纤维素酶CcCel9A的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种构建权利要求1所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的引物，其特征在于：

获得H372A/Y415A突变的引物为：

Y415AF1 5’−3’： GATGATTCATGCGCCAACGCTACCCAGACAC，

Y415AR1 5’−3’：GCGTTGGCGCATGAATCATCATAGCTGTG；

H372AF1 5’−3’：TATCCGAAGAATCCTGCTCACAGGACAG，

H372AR1 5’−3’：GCAGGATTCTTCGGATAATTGGTACCG；

获得H123A突变的引物为：

H123AF1 5’−3’：GACGGCAGCCTTGACGCCGCATGGTGGGGGCCTG，

H123AR1 5’−3’：CAGGCCCCCACCATGCGGCGTCAAGGCTGCCGTC；

获得R374A突变的引物为：

R374AF1 5’−3’：GAAGAATCCTCATCACGCGACAGCTGAAAG，

R374AR1 5’−3’：GCGTGATGAGGATTCTTCGGATAATTGG。

3.一种权利要求1所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的构建方法，其特征在于：

根据CcCel9A活性中心的特点，确定突变的亚位点，通过PCR的引物设计引入突变，构建点突变基因的表达载体，转入大肠杆菌，然后通过诱导表达得到突变体蛋白。

4.按权利要求3所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的构建方法，其特征在于：获得H372A/Y415A突变的引物为：

Y415AF1 5’−3’：GATGATTCATGCGCCAACGCTACCCAGACAC，

Y415AR1 5’−3’：GCGTTGGCGCATGAATCATCATAGCTGTG；

H372AF1 5’−3’：TATCCGAAGAATCCTGCTCACAGGACAG，

H372AR1 5’−3’：GCAGGATTCTTCGGATAATTGGTACCG；

获得H123A突变的引物为：

H123AF1 5’−3’：GACGGCAGCCTTGACGCCGCATGGTGGGGGCCTG，

H123AR1 5’−3’：CAGGCCCCCACCATGCGGCGTCAAGGCTGCCGTC；

获得R374A突变的引物为：

R374AF1 5’−3’：GAAGAATCCTCATCACGCGACAGCTGAAAG，

R374AR1 5’−3’：GCGTGATGAGGATTCTTCGGATAATTGG。

5.一种权利要求1所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的应用，其特征在于：所述重组纤维素酶在调控底物主产纤维四糖中的应用；所述底物为含纤维素的物质。