[发明专利]一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用

说明书

本发明属于酶工程领域，具体的说是一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用。持续性内切纤维素酶CcCel9A调控主产纤维四糖突变的靶位点为H123，H372，R374和Y415中的一种或几种。本发明所示内切纤维素酶可以在大肠杆菌中快速表达，且酶活高，稳定性强，可以与其它酶复配进行纤维素水解。本发明利用纤维素底物产生的纤维四糖浓度大，纯度高，可作为标准品用于科学研究。

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体的说是一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用。

背景技术

纤维四糖(cellotetrose),化学结构式为(β-D-Glc-[1→4])₃-D-Glc，由4个葡萄糖单元以β-1,4糖苷键连接构成，主要用于标准品。由于木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物质资源，因此纤维素酶的研究多年来热度不减。纤维寡糖在纤维素酶的研究中通常是必须的，尤其是在研究酶的最小底物及产物谱的过程中。另外，纤维四糖能促进人和动物肠道内双歧杆菌的增殖，利于肠道蠕动，但不会被肠道吸收。纤维四糖的甜度约为蔗糖的30％～40％，因此可以作为甜味添加剂代替蔗糖用于糖尿病患者的食品。然而，目前纤维四糖的生产使用化学合成方法，纯化流程复杂，使得其生产成本非常昂贵。进而现急需一种纯度较高，节约成本且绿色环保的用于产纤维四糖的生物酶解法。

发明内容

本发明目的是通过酶工程方式改造获得一种主产物为纤维四糖的重组纤维素酶及其构建方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种调控主产纤维四糖突变的靶位点，持续性内切纤维素酶CcCel9A调控主产纤维四糖突变的靶位点为H123，H372，R374和Y415中的一种或几种。

一种利用所述的调控突变的靶位点主产物为纤维四糖的重组纤维素酶，重组纤维素酶为产纤维四糖的持续性内切纤维素酶CcCel9A中在H123A、R374A或H372A/Y415A位点突变所得突变体。

所述产纤维四糖的持续性内切纤维素酶CcCel9A为Clostridiumcellulosi CS-4-4菌株(Zhang,K.；Chen,X.；Schwarz,W.H.；Li,F.,Synergism of glycoside hydrolasesecretomes from two thermophilic bacteria cocultivated on lignocellulose.ApplEnviron Microbiol 2014,80(8),2592-601.)中的持续性内切纤维素酶CcCel9A；其基因序列如SEQ ID NO：1中所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2中所示。

一种构建权利所述的主产物为纤维四糖的重组纤维素酶的引物：

所述获得H372A/Y415A突变的引物为：

Y415AF1(5’-3’)GATGATTCATGCGCCAACGCTACCCAGACAC，

Y415AR1(5’-3’)GCGTTGGCGCATGAATCATCATAGCTGTG；

H372AF1(5’-3’)TATCCGAAGAATCCTGCTCACAGGACAG，

H372AR1(5’-3’)GCAGGATTCTTCGGATAATTGGTACCG；

所述获得H123A突变的引物为：

H123AF1(5’-3’)GACGGCAGCCTTGACGCCGCATGGTGGGGGCCTG，

H123AR1(5’-3’)CAGGCCCCCACCATGCGGCGTCAAGGCTGCCGTC；

所述获得R374A突变的引物为：