[发明专利]前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子制备方法

说明书

本发明涉及前列腺酸性磷酸酶/粒‑巨噬细胞集落刺激因子制备方法。具体地，本发明涉及一种用于编码前列腺酸性磷酸酶/粒‑巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM‑CSF的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码如SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。本发明还提供了高效表达PAP/GM‑CSF的表达载体、工程细胞及制备方法等。本发明构建的PAP/GM‑CSF表达工程细胞具有表达量高，表达稳定等优点，所采取的纯化工艺稳定可靠，得率高，利于大规模生产。

技术领域

本发明涉及一种重组融合蛋白的制备，具体涉及一种前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM-CSF的制备方法，属于生物医药领域。

背景技术

前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase,PAP)是人类前列腺组织中最丰富的酶，分子量为100kD，由两个催化活性的亚基通过非共价键结合形成一个活性酶二聚体。PAP的二级结构由44％的α-螺旋、12％的β-折叠，其余的都是β转角和环构成，人源前列腺酸性磷酸酶(human prostatic acid phosphatase,hPAP)的活性主要依赖其蛋白的二级结构。PAP在体内有两种存在形式：分泌型PAP(secreted prostatic acid phosphatase,S-PAP)和跨膜型PAP(transmembrane prostatic acid phosphatase,TM-PAP)。S-PAP为前列腺上皮细胞合成和分泌，贮存于精囊，参与精液液化与生殖，其产生和分泌受雄激素的调节，具有组织特异性。正常状态下，S-PAP在血中含量极低，只有在疾病状态(如前列腺癌)下才大量进入血液，并可产生抑癌作用。因此近五十年来，PAP一直被作为前列腺癌的肿瘤标志物及特异性免疫治疗的靶点用于临床诊断和治疗。TM-PAP分布于细胞膜上，其C端带有跨膜结构域，主要表达于非前列腺组织，如神经组织、肝脏等。TM-PAP位于胞外的N端部分结构与S-PAP完全相同，包含一个信号肽和酸性磷酸酶结构域。

目前，前列腺癌是危害男性健康常见的恶性肿瘤，在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为危害男性健康第一位的肿瘤。中国的前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势。前列腺癌的治疗方法有很多中，但对于激素抵抗性前列腺癌的治疗目前仍没有有效的方法，化疗尽管对激素抵抗性前列腺癌的生存率有一定作用但其作用相当有限，故仍然需要更有效的治疗方法。肿瘤疫苗是目前一种新的肿瘤治疗方法，通过特异性抗原激活机体免疫系统，识别肿瘤细胞进而特异性杀伤肿瘤细胞。由于分泌型PAP是只在前列腺组织和95％的前列腺癌细胞中表达的抗原分子，PAP已成为转移性非雄激素依赖性前列腺癌特异性的免疫治疗的热门靶点，以其为中心的各项免疫治疗研究正在进行。Johnson等成功构建了编码人PAP的质粒DNA疫苗(pTVG.HP)和病毒载体疫苗(VV-HP)，并将其分别免疫Lewis大鼠，结果证实编码人PAP的质粒DNA疫苗能够诱导PAP特异性CD4和CD8细胞反应，主要是Thl型免疫反应，PAP特异性IgG抗体反应成剂量依赖性，抗体滴度随免疫的次数而增加(Johnson LE,Frye TP,Chinnasamy N,et al.Plasmid DNA vaccine encodingprostatic acid phosphatase is effective in eliciting autologous antigen-specific CD8+T cells.Cancer Immunol Immunother.2007Jun；56(6):885-95)。但是单独的PAP免疫原性很弱。

因此本领域亟需开发一种高效表达制备PAP疫苗的方法、表达载体和宿主细胞，对于前列腺癌疫苗的制备具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效表达制备PAP疫苗的方法、表达载体和宿主细胞。

本发明的第一方面，提供了一种用于编码前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子PAP/GM-CSF的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。