[发明专利]一种K亚群禽白血病病毒检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种K亚群禽白血病病毒检测试剂盒，涉及病毒荧光定量PCR检测技术领域。本发明的试剂盒含有1对特异性引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.2‑3所示。本发明试剂盒使用方法简单、成本低廉，反应结果易于观察，灵敏度高、特异性强，可快速地检测K亚群禽白血病病毒，非常适用于疾病监测、现场应急以及临床标本的检测，适合大范围推广应用。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测K亚群禽白血病病毒的靶序列、荧光定量PCR引物，本发明还涉及利用该靶序列进行K亚群禽白血病病毒检测的方法和试剂盒。

背景技术

目前，针对禽白血病的防控与治疗没有有效的的疫苗和药物，国内外对禽白血病病毒(ALV)的控制主要是定期对种鸡进行ALV抗原检测，淘汰带毒阳性鸡，以达到彻底清除ALV的目的。K亚群禽白血病病毒(ALV-K)是近几年新发现的一种新亚型禽白血病病毒，其致瘤能力弱，体内外复制能力弱。但是，禽白血病病毒易突变，其潜在的威胁同样不能忽视，所以对ALV-K的检测及净化是势在必行的。对于ALV的检测，常用方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光实验(IFA)、聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)及荧光定量RT-PCR等，其中ELISA检测有商品化的抗原检测试剂盒，其操作方便、稳定性好、特异性强，是净化ALV最常用的检测方法。但是其针对ALV的保守蛋白P27，不能用于区分所检ALV所属亚群，尤其是不能排除内源性ALV的干扰。IFA检测需要细胞培养技术作为支撑，对检测人员专业能力要求严格。PCR和LAMP操作简便，灵敏性高，但其不能用于病毒基因的病毒载量结果的定量，而且检测结果存在一定的假阳性干扰。RT-PCR技术已经广泛用于ALV-A/B/J的检测，其灵敏性高，稳定性好，特异性强，常用于病毒基因的检测及病毒载量的定量。

虽然荧光定量PCR检测技术非常成熟，但是针对ALV-K病毒的荧光定量检测方法鲜有报道，原因主要是ALV-K核苷酸序列与禽白血病病毒(ALV)其他亚群的核苷酸同源性非常高，不利于选择特异性目标靶序列，例如ALV-K全长核苷酸序列与内源性禽白血病病毒(ALV-E)全长核苷酸序列同源性在93.7％-97.5％之间，两个亚群之间囊膜蛋白基因env仅有166bp左右的序列存在明显差异，其次，ALV-K国外分离株及国内不同地区分离株之间gp85基因的同源性在94.5％-99.9％不等，这进一步缩小了引物设计的序列可选择空间，导致ALV-K保守序列可供选择的空间较小，筛选难度较大，而在引物设计方面，几个碱基的差别会极大程度上影响引物的特异性，进而导致检测结果的不准确。为了丰富ALV-K的检测手段，并对ALV-K的感染进行定量，亟须设计并筛选出一对灵敏性好、特异性强的引物用于ALV-K的检测和定量，以加快禽白血病的净化进程。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的特异性靶序列；本发明的还在于提供上述靶序列的用途，以提高对K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的检测能力。

为实现上述目的，通过对本实验室分离到的16株K亚群禽白血病病毒(ALV-K)和NCBI数据库已报道的(ALV-K)序列比对，通过BLAST软件进行序列同源性分析，找到特异性的保守靶序列，发现了核苷酸完全保守区域，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该靶序列是检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的遗传标记物。

进一步，本发明还提供用于特异性扩增上述靶序列的引物。本发明的引物不但适用于已报道的国外ALV-K扩增还适用于国内ALV-K扩增检测。

在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为：

F1:5'-CAGACAGGTTCTCGCTTCCG-3'，

R1:5'-CCATATACCTCCTGTGCGTGT-3。