[发明专利]一种鲍鱼血细胞处理方法

说明书

本发明公开了一种鲍鱼血细胞处理方法，首先在2ml离心管中加入1ml抗凝保护剂；然后用解剖刀划开鲍鱼腹足部血窦，将鲍鱼倾斜20‑30°放在冰上以便血液更易流出；待血液流出，用无菌注射器抽1ml血直接注入到加入抗凝保护剂后的离心管中；用一种用于流式细胞仪检测的血液过滤器过滤血液到新的2ml离心管中；再经18℃，3000rpm离心10min，去掉上清；最后用1ml滤菌海水重新悬浮血细胞制成鲍血淋巴悬液。该方法通过采用合适的血液抗凝保护剂和血液过滤器，能够有效的延长血细胞的凝集时间，快速过滤血液中的杂质，改善血液的纯度，减少实验误差，使实验结果更加准确。

技术领域

本发明涉及鲍鱼血细胞处理技术领域，具体涉及一种鲍鱼血细胞处理方法。

背景技术

鲍鱼由于营养丰富，经济价值高，成为我国重要的海水养殖品种。目前，在生物实验领域，并没有一种完全针对鲍鱼血细胞的统一处理方式。人们通常采用各种不同的方式来处理鲍鱼的血细胞。在不加抗凝保护剂的情况下，鲍鱼血细胞一旦离体，几分钟内即大量凝集。即便加入某些抗凝保护剂的鲍鱼血细胞也会在短时间内大量死亡。这样不仅要求实验在短时间内就要完成，还会导致实验结果受系统误差影响较大、实验成本增加，实验结果不准确等问题。因此快速处理血细胞，确保在一定时间内鲍鱼血细胞不凝集在实验中十分重要。

目前，用于流式细胞仪检测的贝类(鲍鱼)血液，并没有一套完整或正规的处理装置，人们一般将收集到的血液不经过滤处理就直接进行流式细胞仪检测。结果表明，没有经过处理的血液含有较多杂质，呈现出来的图像是一个比较混乱、杂乱无章的散点图。另外，未处理细胞群容易造成检测仪堵塞，需要花很长的时间对检测仪进行清洗(10-40min)，才能继续进行测样。这样不仅耽误检测的进程，也无形间造成测试费用升高(200元/h)。所以在鲍鱼血细胞处理过程中采用合适的血液过滤器也十分必要。

发明内容

本发明的目的在于提供鲍鱼血细胞处理方法，通过采用合适的血液抗凝保护剂和血液过滤器，能够有效的延长血细胞的凝集时间，快速过滤血液中的杂质，改善血液的纯度，减少实验误差，使实验结果更加准确。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鲍鱼血细胞处理方法，其特征在于，所述处理方法包括如下步骤：

(1)首先在2ml离心管中加入1ml抗凝保护剂；

(2)然后用解剖刀划开鲍鱼腹足部血窦，将鲍鱼倾斜20-30°放在冰上以便血液更易流出；

(3)待血液流出，用无菌注射器抽1ml血直接注入到加入抗凝保护剂后的离心管中；

(4)用一种用于流式细胞仪检测的血液过滤器过滤步骤(3)中液体到新的2ml离心管中；

(5)再经18℃，3000rpm离心10min，去掉上清；

(6)最后用1ml滤菌海水重新悬浮经过步骤(5)处理的血细胞制成鲍血淋巴悬液。

上述鲍鱼血细胞处理方法中，所述抗凝保护剂由以下成分组成：氯化钠2.45～2.55g、EDTA0.9～1.1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.22～0.24g和0.1mM PBS 100ml。

优选地，所述抗凝保护剂由以下成分组成：氯化钠2.5g、EDTA 1g、 1，4-哌嗪二乙磺酸0.23g和0.1mM PBS 100ml。

上述鲍鱼血细胞处理方法中，所述抗凝保护剂的制备方法为：

(1)将0.1mM PBS缓冲液倒入烧杯中，再向烧杯中加入固体氯化钠粉末搅拌3-5分钟，直到氯化钠全部溶解，然后再加入1，4-哌嗪二乙磺酸粉末充分搅拌溶解得混合溶液A；

(2)将混合溶液A放入38-40℃水浴锅中加热，再缓慢加入EDTA，边加入边搅拌，直到EDTA完全溶解得混合溶液B；