[发明专利]大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用

权利要求书

1.大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及sertoli细胞的标记方法，包括：探针的制备、切片的制备、荧光原位杂交，其特征在于：所述切片的制备步骤为：杂交前实验所用器皿，试剂均采用0.1%DEPC处理，并高压消毒；用多聚甲醛溶液固定样品过夜，使用梯度甲醇脱水，之后以石蜡包埋，将包埋好的性腺样品进行组织切片，切片厚度为4-5μm，切片用DEPC处理水展好，烘干过夜后冷藏；

所述切片的制备步骤中多聚甲醛溶液的浓度为3-4%，将多聚甲醛溶解于pH为7.4的磷酸缓冲液中即得；

所述探针的制备步骤为：从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，0.98-1.05%琼脂糖电泳胶回收，亚克隆并连接到PGEM-Teasy载体，转化大肠杆菌感受态，挑选阳性克隆并测序，挑取含选择正确插入方向的单克隆，中量提取质粒；采用限制性内切酶NcoI、SpeI分别线性化质粒，利用PCR产物回收纯化试剂盒纯化线性化的片段并用DEPC处理水溶解，并采用核酸定量仪定量；用T7和SP6 RNA转录酶分别合成反义和正义探针；

所述荧光原位杂交步骤为：将切片经脱蜡复水操作后置于65℃预杂交液中1-2小时，然后进行杂交，杂交结束后在65℃温度下，以2×SSCT/50%去离子甲酰胺洗涤2*30min，然后以2×SSCT洗涤15min，以0.2×SSCT洗涤2*30min；室温下以1×PBST洗涤3*5min；室温下以2%封闭液封闭1-2h；室温下以2%封闭液按1:500稀释抗体，稀释2小时；室温下1×PBST洗涤5*10min，1×PBS洗涤5*10min；室温下将荧光放大剂按1:150稀释，孵育1小时；1×PBST洗涤5*10min；然后重复进行封闭、稀释抗体、洗涤操作，最后进行细胞核染色，封片后观察拍照；

所述荧光原位杂交包括Amh/Sox9组合的双色荧光原位杂交和Sox9/Gsdf组合的双色荧光原位杂交；

所述Amh/Sox9组合的双色荧光原位杂交后，在Ⅱ期精巢，Amh/Sox9特异性显色于精原细胞和周围的Sertoli细胞；在Ⅲ-Ⅵ期精巢中，Amh在细胞核浓缩基本完成的变态晚期精细胞和精子上不显色，而Sox9在Sertoli细胞和各时期生殖细胞上都显色；

所述Sox9/Gsdf组合的双色荧光原位杂交后，在Ⅱ期精巢，Sox9特异性显色于精原细胞周围的Sertoli细胞；在Ⅲ-Ⅵ期精巢中，Sox9在Sertoli细胞和各时期生殖细胞上都显色；

在各时期精巢中，Gsdf仅特异性显色于精原细胞周围的Sertoli细胞。

2.根据权利要求1所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及sertoli细胞的标记方法，其特征在于：所述探针的制备步骤中，用于鉴定大菱鲆生精上皮不同发育时期不同细胞类型的基因原位杂交探针合成引物为：Amh正向序列：TCCACATTCTCACTCTCGAT，反向序列：AGAGTCTCACCATCTCCCTT；Sox9正向序列：GACTTTGGAGCCGTGGACAT，反向序列：TCACGGTCTGGACAGTTGTG；Gsdf正向序列：TGAAGAACCTGCAGCCTCTG，反向序列：TTACTCTTTGCTGGGCTGCTG。

3.根据权利要求1所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及sertoli细胞的标记方法，其特征在于：所述探针的制备步骤中，反义探针合成时反应各物质及其含量为：酶切质粒1μg、10×NTPmix 2μL、10×Buffer 2μL、RNase Inhibitor 1μL、T7 2μL，以DEPC处理水加至20μL；正义探针合成时反应各物质及其含量为：酶切质粒1μg、10×NTPmix 2μL、10×Buffer 2μL、RNase Inhibitor 1μL、SP6 2μL，以DEPC处理水加至20μL。