[发明专利]大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用

说明书

本发明公开了大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用，从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，经克隆并择优后提取质粒，以限制性内切酶线性化质粒，回收质粒后制备探针，将样品处理后进行固定、脱水、包埋，切片后进行荧光原位杂交，最后进行细胞核染色，封片后观察拍照。有益效果为：本发明方法巧妙地将大菱鲆几个关键发育时期的精细胞及Sertoli细胞区分开，标记方法简单易行，精确度较高；大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法可以应用于其他海洋生物的生精上皮细胞区分及标记，为今后鱼类的精子发生及生精上皮内环境研究提供有效方法和科学依据。

技术领域

本发明涉及鱼类细胞标记方法领域，尤其是涉及大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用。

技术背景

精子发生(Spermatogenesis)是指生殖细胞从精原细胞(Spermatogonia)发育为成熟的精子(Spermatozoa)的过程。生精上皮是精子发生的唯一场所，包括生殖细胞(germcell)和体细胞(Sertoli cell)。哺乳动物的整个精子发生过程都在Sertoli细胞的孵育下完成。鱼类的精细胞在由Sertoli包裹组成的囊状结构(精小囊Spermatogenic Cysts)中发育、成熟。因此，生精上皮的生殖细胞和体细胞的数量和功能直接决定了个体产生精子的质和量。

遗憾的是，有关大菱鲆在内的海洋鱼类生精上皮的研究还十分有限，尚缺乏关键发育阶段生殖细胞及体细胞的有效分子标记。给大菱鲆的精子发生研究带来诸多不便，阻碍了对大菱鲆及其他鱼类生殖生物学相关方面的研究。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，本标记方法可以巧妙地将几个关键发育时期的精细胞及Sertoli细胞区分开，可以捕捉精细胞变态的各个动态时期，填补大菱鲆精细胞变态阶段划分的研究空白，而且操作简单，精确度较高。

本发明的目的之二在于提供一种大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法的应用，本标记方法可以应用于其他海洋生物的生精上皮细胞区分及标记，为今后鱼类的精子发生及生精上皮内环境研究提供有效依据和科学方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，包括：

探针的制备：用于鉴定大菱鲆生精上皮不同发育时期不同细胞类型的基因原位杂交探针如表1所示，从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，0.98-1.05％琼脂糖电泳胶回收，亚克隆并连接到PGEM-T easy载体，转化大肠杆菌感受态，挑选阳性克隆并测序，挑取含选择正确插入方向的单克隆，中量提取质粒；

表1.Amh/Sox9/Gsdf RNA探针合成引物

采用限制性内切酶(NcoI、SpeI)分别线性化质粒，利用PCR产物回收纯化试剂盒纯化线性化的片段并用DEPC处理水溶解，并采用核酸定量仪定量；用T7和SP6RNA转录酶分别合成反义和正义探针，反应各物质及其含量如表2所示；

表2.反义探针、正义探针反应的物质及其含量

混匀后，于36-37℃孵育100-120分钟；加入2μLDnase I，36-37℃孵育15-18分钟；加入2μL0.18-0.20mol/LEDTA溶液，EDTA溶液的pH为7.9-8.0；加入3μL4.0-4.2mol/LLiCl溶液及75-80μL预冷的100％酒精，于-20～-25℃放置2-2.5小时；1-4℃、12000-12500rpm离心10-15分钟，70％酒精洗涤2-3次；空气干燥，用20μLDEPC处理水溶解，并定量；用预杂交缓冲液稀释至100ng/μL并于-20～-30℃保存；