[发明专利]用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法

说明书

本发明涉及用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法。其包括以下步骤：AM真菌与共生植物根系建立共生体；利用荧光染料溶液处理AM真菌根组织，分段后置于载玻片上，并用盖玻片封片；利用激光共聚焦显微镜观察收集图像及进行图像处理。通过本发明可以灵敏的分析观察和判断AM真菌和其他侵染植物是否建立共生关系，可以作为鉴定AM真菌是否与植物共生的灵敏方法；通过本发明易于三维立体观察和分析根系菌根丛枝结构的发育；根据观察到的菌根真菌丛枝结构在植物根部的分布情况，可以用本发明同时研究与丛枝结构对应的植物根细胞质膜的膨大部分，叫做围丛枝膜的生物学功能，如营养物质氮﹑磷输运蛋白基因在膜上表达的比较研究。

技术领域

本发明具体涉及用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法。

背景技术

菌根是植物根系和菌根真菌形成的共生体，自然界中的菌根分为外生菌根和内生菌根。丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal，AM)真菌是自然界中普遍存在的一类内生菌根真菌，地球上约90%的维管束植物都能与其形成丛枝菌根。AM真菌与宿主植物互惠共生：真菌的根外菌丝体（Extraradical Mycelium,ERM）从土壤中吸收磷、氮素及其它营养元素供给宿主植物，改善了植物对矿质元素的吸收能力，促进植物生长，增强植物的抗逆性等，宿主植物则供给真菌生长所必需的碳水产物。AM真菌的结构主要分为丛枝、菌丝和孢子，除了巨孢囊霉属和盾孢囊霉属以外大多数AM真菌还具有泡囊结构。丛枝是AM真菌繁殖体侵染植物根的根内菌丝，菌丝在皮层细胞内不断分叉分枝形成的枝状结构（arbuscule）；与之对应的是植物根细胞质膜的膨大部分，叫做围丛枝膜（PAM，periarbuscular membrane）。围丛枝膜以及与丛枝结构包围的间隙叫做围丛枝空间（PAS，periarbuscular space），围丛枝空间PAS是真菌与植物共生体进行营养与信息交换的主要场所。

随着AM真菌丛枝结构的形成，根部皮层细胞发生巨大变化，这需要重新组织细胞质膜，包括细胞骨架和细胞器的重构，尤其是膜面积的巨大增加。其中有些细胞的改变已经用以前传统的抗体和荧光蛋白融合标记技术检测，但是这些菌根侵染细胞仍有很多生物学方面的功能是目前传统技术研究不清楚的。

此外，由于传统的光学显微镜只能观察染色后的丛枝状结构，而且只能是一个平面上的物像，所以不能全面观察了解丛枝状结构，影响了对其生物功能的进一步研究和了解。于是迫切需要一种能够三维立体、多角度观察的显微方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法的技术方案。

所述的用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）AM真菌与共生植物根系建立共生体；

2）利用荧光染料WGA-Alexa fluor488 溶液处理AM真菌根组织，分段后置于载玻片上，并用盖玻片封片；

3）利用激光共聚焦显微镜观察收集图像及进行图像处理。

所述的用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法，其特征在于所述的步骤1）具体为：将生根3个星期的共生植物，从MS琼脂培养基中取出，转移到含有MS培养基的培养皿上，同时接种上与胡萝卜根侵染的丛枝菌根真菌孢子或菌丝，进行共生培养。

所述的用激光共聚焦显微镜和荧光染料观察AM真菌丛枝结构的方法，其特征在于所述的步骤2）具体为：

a、将步骤1）得到的AM真菌侵染的植物根浸泡于50%乙醇1小时；

b、用水清洗后，放入20%KOH溶液中90℃保温2小时，再分别用蒸馏水和PBS缓冲溶液洗涤；