[发明专利]利用筑波链霉菌提高他克莫司发酵产量的方法

说明书

本发明涉及利用筑波链霉菌提高他克莫司发酵产量的方法。本发明通过基因工程手段，首次向筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis NRRL 18488)基因组中插入正调控基因tsuZ及其靶基因tsuS2，来增加基因工程菌中正调控基因tsuZ及其靶基因tsuS2表达量，以达到提升基因工程菌发酵产FK506能力之目的。通过上述策略构建出的基因工程菌发酵FK506产量为324mg/L，较出发菌株‑S.tsukubaensis NRRL18488产量提高了36％。因此，本发明对于提升菌株发酵FK506产量具有很大的应用潜力。同时，也为利用基因工程手段改造菌株发酵高产FK506提供新的方法。

技术领域

本发明属链霉菌基因工程技术领域，涉及一种S.tsukubaensis的正调控基因tsuZ及其靶基因tsuS2共表达构建基因工程菌的方法，以及利用该方法所构建的基因工程菌在提高他克莫司产量中的应用。

背景技术

他克莫司(Tacrolimus，简称FK506)是一种23元大环内酯类免疫抑制剂，于1984年首次由日本藤泽制药公司从S.tsukubaensis代谢产物中分离得到。FK506作为高效的免疫抑制剂，其具有免疫抑制药效强、用药剂量低、急性排异反应发生率低等优点，因而已广泛应用于器官移植、皮肤病、自身免疫系统紊乱以及癌症等多种疾病治疗之中。然而，FK506是一种结构复杂的次级代谢产物，其生产受到发酵周期长、产量低和成本高等诸多因素的制约，严重影响了FK506在医学领域的应用以及工业化生产规模。

目前，筛选FK506高产菌株常常采用物理或化学方法进行菌株诱变以获得高产菌株，或采用莽草酸和油脂耐受性等策略来筛选FK506高产菌株。然而，利用上述方法获得的高产菌株常存在回复突变频率高、工作强度大、费时费力以及不确定性大等缺点，严重限制FK506的工业化生产。因此，利用基因工程手段对FK506生产菌株进行重新构建以及改造，以达到提升菌株发酵高产FK506的目，满足工业和临床的实际应用需求。

S.tsukubaensis中存在着错综复杂的代谢调控网络，并严格控制着抗生素的合成。其中，调控因子对于S.tsukubaensis抗生素产量产生严重影响。例如，在S.tsukubaensis L19中，通过共表达tcs7、fkbN2个正调控因子，基因工程菌株发酵产FK506产量较原始菌株提高了89％；在S.tsukubaensis KCCM11116P中，分别对内源型SARP家族转录调控因子bulZ、bulY及来源于海洋链霉菌的异源型调控基因sx5140进行高表达，结果表明3个调控因子均能提高FK506合成量。然而，调控因子也会出现自调控或受到其他调控因子的控制，以维持其浓度在胞内的平衡，遂导致提高调控因子的拷贝数也不能明显提高抗生素的产量。

研究表明，调控因子可通过控制相应靶基因以对链霉菌的初级代谢、次级代谢、形态分化、营养物质的吸收以及有害物质的排出等，因而共同增加正调控因子及其靶基因的拷贝数可避免因调控因子浓度低而造成相应靶点表达量不高的问题。但是，共表达正调控因子及其靶基因构建高产FK506基因工程菌株策略未在S.tsukubaensis中进行使用。因此，本发明首次向S.tsukubaensis基因组中整合外源的正调控基因tsuZ及其靶基因tsuS2，来构建基因工程菌，以达到提升基因工程菌发酵产FK506能力之目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用筑波链霉菌提高他克莫司发酵产量的方法；具体步骤如下：

1)根据tsuZ和tsuS2已知序列设计PCR引物，以S.tsukubaensis NRRL18488基因组DNA为模板，扩增正调控因子tsuZ基因以及其靶基因tsuS2；

2)将正调控基因tsuZ与靶基因tsuS2通过融合PCR串联成一个大片段，将所得大片段整合到表达载体pIB139中，得到重组表达载体pOtsuZS2；