[发明专利]评估水中污染物的神经性毒性的方法

说明书

本发明提供评估水中污染物的神经性毒性的方法。包括：配制10％地表水浓度的溴氰菊酯溶液；选取适量的斑马鱼分别在曝气水和10％地表水浓度的某污染物溶液中进行为期七天的连续暴露，分别即为空白组和实验组；对上述空白组和实验组的斑马鱼脑部进行解剖，提取总RNA、反转录成cDNA，并进行实时荧光定量PCR扩增；用2^－△△CT法对对实验数据进行相对定量分析，并绘制折线图，根据实验结果评估水中污染物可能对毒蕈碱受体(M1受体)的功能的影响。步骤简单、操作方便、实用性强。

技术领域

本发明属于环境监测领域，涉及一种利用分子技术手段评估水污染对人体健康的潜在危害的方法。

背景技术

随着斑马鱼基因组测序工作的完成，发现斑马鱼的基因与人类的基因的保守度高达85％，这使得斑马鱼成为一种研究人类疾病的模式动物，越来越受到人们的关注。同时，斑马鱼胚胎发育遗传学技术的逐步建立和完善也为斑马鱼的人类疾病模型的和分析提供了良好的基础。溴氰菊酯具有选择毒性，相比鸟类和哺乳类等，鱼类对溴氰菊酯的毒性更加敏感。因而，选择斑马鱼作为监测对象，是个不错的选择。

目前，水质评估的方法多样，如理化分析方法(如滴定、分光光度分析等)、现代仪器分析方法(色谱分析、光谱分析等)、生物监测法等。而且涉及的生命层次也比较广泛，从群落到种群再到生物个体的研究比比皆是。而在分子层次评估水质变化，相对比较匮乏。值得注意的是，水中污染物的毒性效应，有的能即刻表现出来，有的潜伏期相对较长。这就需要从水生生物的内部生理变化反应水质的变化。

专利CN201510315920.7公开了一种双抗夹心ELISA定量检测方法，通过双抗夹心法定量检测斑马鱼M3a受体蛋白的含量并评估水质的变化。但由于双抗夹心法检测时间较长、难以做到及时、准确。

史慧勤的论文《药物神经毒性评价斑马鱼模型的建立及氯胺酮神经发育毒性机制研究》应用RT-PCR法检测亚麻剂量氯胺酮的斑马鱼中枢神经NMDA受体亚基表达情况，以评估斑马鱼幼鱼神经发育毒性作用及剂量-行为效应机制。但由于NMDA受体亚基含量、分布范围较窄，缺乏广泛的适用性。

发明内容

为了克服上述问题，本申请针对现有水质评估中，关于溴氰菊酯毒性评估方法的不足，提出了一种利用M1受体的相对表达来评估水中污染物(溴氰菊酯毒性)对人类健康的潜在危害的方法。

M1受体是毒蕈碱型乙酰胆碱受体的一个亚型，在大脑中分布最为广泛，占大脑皮层和海马的40％-50％。M1受体与阿尔茨海默病(AD)关系密切。淀粉样肽沉积物是阿尔茨海默病的特征之一，M1受体的激活能保护神经元免受淀粉样肽(Ah)毒性。M1受体与认知过程有关，参与调节学习和记忆，保护细胞免受凋亡作用引起的损伤，包括DNA损伤、氧化应激和皮质中神经元线粒体的损伤。心肌细胞中也含有M1受体，且M1受体可导致心率的下降。利用M1受体与神经性疾病的密切关系。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用斑马鱼对水中污染物的神经性毒性的潜在风险进行评估的方法，包括：

配制10％地表水浓度的溴氰菊酯溶液；

选取适量的斑马鱼分别在曝气水和10％地表水浓度的某污染物溶液中进行为期七天的连续暴露，分别即为空白组和实验组；

对上述空白组和实验组的斑马鱼脑部进行解剖，提取总RNA、反转录成cDNA，并进行实时荧光定量PCR扩增；

用2^－△△CT法对对实验数据进行相对定量分析，并绘制折线图，根据实验结果评估水中污染物可能对毒蕈碱受体(M1受体)的功能的影响。