[发明专利]Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用

权利要求书

1.一种Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、设计针对斑马鱼cebpa基因的TALEN序列；

S2、构建TALEN的左、右臂质粒，并分别体外转录出TALEN左、右臂mRNA；

S3、将TALEN左、右臂mRNA混合并显微注射到斑马鱼受精卵中；

S4、将注射后的胚胎养至F0成鱼，并与野生型成鱼交配，对产生的胚胎进行限制性内切酶方法以及DNA测序方法鉴定，将携带有cebpa基因突变的胚胎养至F1成鱼；

S5、对F1成鱼进行剪鱼尾鳍抽提基因组DNA方法鉴定是否存在cebpa基因突变，并通过DNA测序方法确定其cebpa基因突变类型，将含有cebpa基因突变的F1成鱼再次与野生型成鱼交配，产生的胚胎养至F2成鱼；

S6、对F2成鱼通过剪鱼尾鳍抽提基因组DNA的方法鉴定，确定突变鱼系，该突变鱼系即所述Cebpa基因缺失斑马鱼突变体。

2.根据权利要求1所述的Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，TALEN序列的左臂序列如SEQ ID N0.1所示，TALEN序列的右臂序列如SEQ ID N0.2所示。

3.根据权利要求1所述的Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤S2中还包括注射后待胚胎发育至2-3天，挑选若干枚正常发育的胚胎，抽提基因组DNA，并对cebpa基因进行PCR扩增，PCR扩增产物通过限制性内切酶的方法鉴定TALEN是否有效的步骤。

4.根据权利要求3所述的Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，对cebpa基因进行PCR扩增采用的引物序列如SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所示。

5.根据权利要求1所述的Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤S6中还包括克隆斑马鱼cebpa突变基因至pCS2+表达载体中，通过荧光素酶报告实验检测该突变C/ebp α是否还具有转录活性功能的步骤。

6.根据权利要求1所述的Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤S6中还包括将F2代cebpa突变体自交产生的胚胎养至4-6天，利用苏丹黑染色的方法检测cebpa基因敲除胚胎的粒细胞发育情况的步骤。

7.一种根据权利要求1所述的Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法建立的cebpa基因缺失斑马鱼模型在作为针对治疗白血病，肝脏发育不良以及粒细胞缺失疾病的药物筛选模型中的用途。