[发明专利]Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用

说明书

本发明公开了一种Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用；设计针对斑马鱼cebpa基因的TALEN序列；构建其左右臂质粒，并体外转录出相应的mRNA；将TALEN左右臂mRNA混合并显微注射到斑马鱼受精卵中；注射后的胚胎养至F0成鱼与野生型成鱼交配，将携带有cebpa基因突变的胚胎养至F1成鱼；含有cebpa基因突变的F1成鱼再与野生型成鱼交配，产生的胚胎养至F2成鱼，通过剪鱼尾鳍抽提基因组DNA的方法鉴定，确定所述突变体。本发明通过TALEN基因编辑技术，能够快速高效的建立cebpa基因缺失斑马鱼品系，利用该模型能够开展针对治疗白血病，肝脏发育不良以及粒细胞缺失等疾病的药物筛选工作。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，涉及一种由TALEN介导的Cebpa基因缺失型斑马鱼突变体的制备及其应用。

背景技术

CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding proteinα，C/EBPα)是C/EBPs转录因子家族中的重要成员，由单一外显子编码，其C端具有高度保守的DNA结合结构域和二聚化功能域(basic region and leucine zipper domain，bZIP)。研究发现，C/EBPα在造血发育，肝脏发育以及脂肪细胞分化等过程中发挥着重要作用，其功能异常更是与多种疾病的发生及发展密切相关。在急性髓系白血病患者中，C/EBPα基因突变率大约为5％-14％。

斑马鱼作为一种新兴的模式生物，兼具了“小模式生物”(如酵母，线虫，果蝇)和“大模式生物”(如小鼠)的众多优势：斑马鱼成鱼体长3-4cm，易于实验室大规模饲养；一次交配可产数百枚胚胎，方便进行大规模的化学诱变剂突变筛选及活体高通量药物筛选；从受精卵发育到性成熟个体时间短，仅需2-3个月时间；斑马鱼体外受精，胚胎体外发育，早期透明，易于实时观测和操作；二倍体生物，斑马鱼基因组测序工作已经完成，其许多信号通路及重要基因都与人类高度保守，并且其神经系统，免疫系统，心血管系统，生殖系统等的发育和功能也与人类有许多的共同点，可以作为研究人类发育和疾病的动物模型。此外，随着研究的深入，许多研究手段和方法也都日趋成熟。由此可见，斑马鱼是一种非常理想的研究脊椎动物遗传和发育的模式生物。

TALE(Transcription Activator-Like Effector)是由植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)分泌的一类具有转录激活功能的蛋白，该蛋白由一些非常保守的重复氨基酸序列模块组成，每个模块一般包含33-35个氨基酸，其中第12，13位氨基酸种类可变且决定了TALE与DNA结合的特异性。通过将TALE与限制性内切酶FokI融合便形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具-TALEN(transcription activator-like effectornucleases)。在细胞内TALEN与基因组的靶位点结合，并当FokI形成二聚体后便发挥内切酶活性对DNA双链进行切割，从而造成DNA双链损伤。当DNA损伤后，机体会启动两种修复机制，一种为非同源性末端接合机制(Non-homologous End Joining，NHEJ)，另一种为同源重组修复机制(homologous recombination)。在没有外源的同源序列加入时，细胞便会启动NHEJ修复机制，将断裂的DNA末端重新连接在一起。但是，这种修复机制是一种快速的，非精确的修复，极易发生错误(缺失/插入)，从而造成移码突变，因而最终可以达到基因敲除的目的。作为一种新兴的基因组编辑技术，TALEN系统具有操作简单，时间短，成本低等优势。

CRISPR/Cas技术作为另一种基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。虽然CRISPR/Cas技术在靶位点设计上更灵活，简便，但是其特异不高，脱靶率远高于TALEN技术，并且其基因打靶效率也低于TALEN技术。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种由TALEN介导的Cebpa基因缺失型斑马鱼突变体的制备及其应用。cebpa基因与多种疾病的发生及发展密切相关，此模型的建立将具有很好的医学研究价值和商业应用价值。