[发明专利]一种基于穿膜肽的三元基因递送系统及其应用

说明书

本发明公开了一种基于穿膜肽的三元基因递送系统及其应用，基于穿膜肽的三元基因递送系统用下述方法制成：将多功能多肽REDV‑G‑TAT‑G‑NLS‑C通过邻二硫吡啶聚乙二醇活性酯连接到八氨基POSS的八个活性位点上，形成星形聚合物；带有正电荷的星形聚合物与带负电的基因通过静电相互作用结合，形成表面带有负电的二元基因递送系统；富含组氨酸的多肽序列与二元基因递送系统通过静电相互作用结合，形成三元基因递送系统。本发明的基于穿膜肽的三元基因递送系统对内皮细胞具有靶向性，同时具有穿膜肽、组氨酸和核定位信号的功能，有利于携带基因高效地进入细胞，有效地进行内涵体逃逸并进入细胞核，从而大大提高基因递送效果。

技术领域

本发明属于分子生物领域，涉及一种基于穿膜肽的三元基因递送系统及其应用。

背景技术

近年来，随着基因治疗的发展，通过基因治疗各种疾病已经引起了人们越来越多的关注。其中，制约该技术广泛应用的主要瓶颈是缺乏高效低毒的基因递送系统。病毒递送系统因其安全问题备受争议。非病毒基因递送系统很好地避免了病毒载体的这一问题，但是非病毒基因递送系统存在细胞毒性高、选择性差、细胞摄取效率低、内涵体逃逸困难、进细胞核困难、转染效率差、基因表达水平低等都是基因递送系统携带治疗基因无法进行疾病治疗的主要问题。

近年来，阳离子聚合物基因递送系统属于非病毒基因递送系统，因其易于制备修饰、高转染效率等特点，受到了人们广泛的关注。但是由于其较高的电荷密度，在具有高的细胞转染效率的同时也具有很高的细胞毒性。因此，如何获得低毒高效的靶向性基因递送系统仍然是研究者们的努力方向。基因递送过程是非常复杂的，需要跨越多层屏障，如何高效的穿过细胞膜、有效的从内涵体逃逸并高效地进入细胞核，仍然是设计基因递送系统的重点。基于穿膜肽的基因递送系统具有很高的生物相容性和特殊的穿膜效果，在基因递送系统设计方面具有很大的发展潜力，但是不稳定性、特异性的缺乏及内涵体逃逸能力差使得其应用也受到了限制。此外，目前的基因递送系统一般是阳离子聚合物与基因的二元基因递送系统，不利于多功能基因递送系统的设计与调控。因此，安全高效特异性基因递送系统的设计优化仍面临着很大的挑战。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有很好的生物相容性、高效低毒、对内皮细胞靶向性的基于穿膜肽的三元基因递送系统。

本发明的第二个目的是提供一种基于穿膜肽的三元基因递送系统的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种基于穿膜肽的三元基因递送系统制备基因递送药物中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种基于穿膜肽的三元基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：

(1)按摩尔比为1：8-16的比例，将八氨基POSS和NHS-PEG-OPSS溶解于pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，室温反应2-3小时；

所述八氨基POSS为八氨基笼状聚倍半硅氧烷的简称；所述NHS-PEG-OPSS为邻二硫吡啶聚乙二醇活性酯的简称；

(2)将REDV-G-TAT-G-NLS-C加入到步骤(1)获得的溶液中，反应4-8小时，采用截留分子量为3500的透析袋透析提纯，冻干，得到POSS-(PEG-NLS-G-TAT-G-REDV)₈聚合物；

所述八氨基POSS和REDV-G-TAT-G-NLS-C的摩尔比为1:8-16；

所述REDV-G-TAT-G-NLS-C的氨基酸序列用SEQ ID NO.1所示；