[发明专利]一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：以淇河鲫肝脏cDNA为模板，采用F/R为引物进行PCR扩增，其中正向引物F：CGGGGTACCATGGCTTTTTATCAGCAACAGCCGT，划线部分为Kpn I酶切位点，反向引物R：CCCAAGCTTTTAAGCCTGCACAAAAGTCAGCTGC，划线部分为Hind III酶切位点，PCR产物CaGal与载体pET-32a连接构建pET-32a-CaGal重组表达载体；将pET-32a-CaGal重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21，即可表达半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，经分离和纯化获得鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，该鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：pET-32a-CaGal重组表达载体的具体构建过程为：

（1）CaGal基因的PCR扩增

提取淇河鲫肝脏总RNA，以OligdT为引物进行cDNA的合成，根据获得CaGal的cDNA序列，设计引物如下：

正向引物F：CGGGGTACCATGGCTTTTTATCAGCAACAGCCGT，划线部分为Kpn I酶切位点；

反向引物R：CCCAAGCTTTTAAGCCTGCACAAAAGTCAGCTGC，划线部分为Hind III酶切位点；

以淇河鲫肝脏cDNA为模板，引物F/R扩增获得963bp的CaGal序列，反应条件为：95℃预变性5min；95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环；72℃终延伸10min；

（2）将得到的PCR产物CaGal与原核表达载体pET-32a分别进行Kpn I和Hind III双酶切，酶切产物回收后于16℃过夜连接；

（3）连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后，37℃ 180rpm振荡培养过夜，提取质粒，Kpn I和Hind III双酶切鉴定及测序结果表明，CaGal基因正确插入到载体pET-32a相应酶切位点，pET-32a-CaGal重组表达载体构建成功。

3.根据权利要求1所述鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21的具体制备过程为：

（1）将鉴定正确的重组表达载体pET-32a-CaGal 5μL加入到预冷的25μL BL21(DE3)感受态细胞中，冰上预冷30min，42℃水浴热激90s，然后冰上放置3min，加入200μL无氨苄青霉素的LB液体培养基复活培养，培养条件为37℃，180rpm，60min；100μL的菌液涂布在含有100µg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-16h；

（2）挑取单菌落接种到含有100µg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒，酶切鉴定，筛选出阳性转化子，获得大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21。