[发明专利]一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用，属于水产动物分子生物学领域。本发明的技术方案要点为：以淇河鲫cDNA为模板，采用F/R为引物进行PCR扩增，PCR产物CaGal与载体pET‑32a连接，构建pET‑32a‑CaGal重组表达载体；转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得大肠杆菌表达菌株pET‑32a‑CaGal‑BL21，即可表达半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，经分离和纯化获得鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白。本发明制备的CaGal重组蛋白可保持其天然生物学活性，能够有效抑制嗜水气单胞菌等病原菌，抑菌效果明显，并且制备方法简单，可作为一种新型的鱼类免疫添加剂或抗菌药物。

技术领域

本发明属于水产动物分子生物学技术领域，具体涉及一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用。

背景技术

淇河鲫（Qihe crucian carp，Carassius auratus），又称“双背鲫”，为天然三倍体鱼类，产于豫北淇河，生长迅速、肉味鲜美且营养价值高，为“淇河三珍”之首，是河南省特有的优质水产品种之一。近年来，伴随淇河鲫养殖范围扩大，养殖密度增加，鱼类免疫力下降，导致病害逐渐增多。其中危害较大的是嗜水气单胞菌引起的淡水鱼类细菌性出血病。该病传播迅速、死亡率极高，严重影响了淇河鲫养殖业的经济与生态效益。因此，深入了解淇河鲫先天免疫，系统研究其感染嗜水气单胞菌后的免疫应答机制，有助于通过多途径联合运用最大限度地提高鱼类免疫力，促进淇河鲫养殖业的可持续发展。

半乳糖凝集素（galectin）是进化上较为保守的凝集素家族成员。具有以下典型特征：具有保守的糖识别结构域（CRD），能够特异性结合β-半乳糖苷，没有信号肽，活性发挥不依赖Ca²⁺，广泛分布于动物、植物及微生物。半乳糖结合凝集素是一类多功能分子，参与RNA转录后加工、肿瘤转化、细胞凋亡、细胞间粘附及细胞生长调节等；并且半乳糖凝集素还作为模式识别受体识别细菌、病毒、真菌及寄生虫的表面糖基，启动先天免疫，在机体的天然免疫防御中发挥重要作用。但是，目前从鱼类中鉴定到的半乳糖凝集素较少。本发明所述半乳糖凝集素CaGal为淇河鲫首例报道的半乳糖凝集素，并且发现该凝集素具有效果明显的抑菌作用。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用，该方法制得的鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白可保持其天然生物学活性，能够有效抑制嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）等病原菌且抑菌效果明显。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：以淇河鲫肝脏cDNA为模板，采用F/R为引物进行PCR扩增，其中正向引物F：CGGGGTACCATGGCTTTTTATCAGCAACAGCCGT，划线部分为Kpn I酶切位点，反向引物R：CCCAAGCTTTTAAGCCTGCACAAAAGTCAGCTGC，划线部分为Hind III酶切位点，PCR产物CaGal与载体pET-32a连接构建pET-32a-CaGal重组表达载体；将pET-32a-CaGal重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21，即可表达半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，经分离和纯化获得鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，该鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步优选，所述pET-32a-CaGal重组表达载体的具体构建过程为：

（1）CaGal基因的PCR扩增

提取淇河鲫肝脏总RNA，以OligdT为引物进行cDNA的合成，根据获得CaGal的cDNA序列，设计引物如下：