[发明专利]一种CIK细胞快速扩增的方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种CIK细胞快速扩增的方法及试剂盒，采用的技术方案是，一种CIK细胞快速扩增的试剂盒，所述试剂盒中包括活化剂、CIK细胞激活剂和CIK细胞增殖剂，所述活化剂由CD3单克隆抗体和IFN‑γ溶于PBS缓冲溶液配制而成；CIK细胞激活剂由IL‑2、IL‑1α和IFN‑γ溶于PBS缓冲溶液配制而成；CIK细胞增殖剂由IL‑2、抗坏血酸、维生素E、人血浆白蛋白和胰岛素组成。本发明具有如下优点：CIK细胞快速扩增方法及试剂盒使用方便，操作简单，能高效、快速扩增CIK细胞，大大缩短培养周期，两周时间即可将50mL～100mL外周血中分离的单个核细胞诱导扩增CIK细胞达到2～8×10¹⁰个。

技术领域

本发明涉及生物技术、生命科学与医学的交叉技术领域，具体涉及一种CIK细胞快速扩增的方法及试剂盒。

背景技术

CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells)，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同诱导而获得的一群异质细胞。是在LAK细胞(淋巴因子活化的杀伤细胞，Lymphokine-activated killer cells)的基础上发展起来的新一代细胞因子活化淋巴细胞。LAK细胞是1982年Grimm等首先报道，在外周血单个核细胞中加入多种细胞因子体外培养4-6天，诱导出的一种非特异性的杀伤细胞，可杀伤多种肿瘤细胞。1984年Rosenberg研究组首次应用IL-2与LAK协同治疗25例肾细胞癌、黑色素瘤、肺癌、结肠癌等肿瘤患者，其中11例肿瘤缩小50％，1例黑素瘤完全消退。1988年该研究组总结了协同治疗的222例肿瘤患者，其中16例患者肿瘤转移灶完全消退，26例患者肿瘤消退50％以上，该疗法对转移性肾细胞癌、黑素瘤、结肠癌和非何杰金氏淋巴瘤的疗效显著。

CIK细胞中CD3⁺CD56⁺双阳性细胞为其主要效应细胞，同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，其故又称为自然杀伤细胞样T淋巴细胞，具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，对肿瘤细胞的识别能力很强，能精确识别杀伤肿瘤细胞，而不会伤及正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力。我国是进行CIK细胞临床试验比较多的国家，有关人士经过统计，国内的CIK细胞临床实验涉及多个方面，例如肝癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、白血病、鼻咽癌等多种恶性肿瘤，总有效率为51.7％。大量研究表明CIK细胞具有比LAK、CTL(细胞毒性T淋巴细胞)、TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)更强的增殖能力和杀伤活性，是一种新型、高效、具有广谱杀瘤活性的免疫效应细胞，且无主要组织相容性复合体(MHC)限制性，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案，在肿瘤免疫治疗中显露出巨大的应用价值。

目前，CIK细胞的常用活化方法是将分离得到的外周血单个核细胞采用CD3单克隆抗体、白细胞介素-1(IL-1α),白细胞介素-2(IL-2)以及γ-干扰素(英文名称IFN-γ)等因子进行活化，进一步长期培养法采用静态和间歇换液的方式进行扩增，然而普遍存在激活效率低、培养周期长及因营养物耗竭或毒副产物积累而限制细胞生长的现象，细胞扩增效果难以满足临床需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CIK细胞快速扩增的方法及试剂盒，用以解决现有CIK细胞扩增效率低、培养耗时长、培养液用量大及不易操作的技术问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案一为：一种CIK细胞快速扩增的方法，包括分离外周血单个核细胞的步骤，所述方法还包括以下步骤：

①活化培养瓶：向培养瓶中加入活化剂至覆盖瓶底，孵育，得活化培养瓶，所述活化剂由CD3单克隆抗体和IFN-γ溶于PBS缓冲溶液配制而成；

②配制活化培养基：向49mL基础培养基中加入1mL的CIK细胞激活剂，得活化培养基，所述CIK细胞激活剂由IL-2、IL-1α和IFN-γ溶于PBS缓冲溶液配制而成；