[发明专利]一种利用贝肉制备ACE抑制肽的方法

权利要求书

1.一种利用贝肉制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.取新鲜贝肉蒸煮切碎后，置于-20℃冰箱冷冻，6h后转入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥48h，粉碎过40目筛得贝肉干粉；

B.将贝肉干粉按料液比1:（3~4）加入蒸馏水进行匀浆，调节pH为6.3~7.0，然后加入40~60mg/ml的磁性碳微球，高压灭菌20~30min后，得到培养基；

所述磁性碳微球的制备方法如下：

（1）将废豆渣与碳酸钾按照质量比1:2溶解于蒸馏水中，室温下浸渍4h，然后干燥至含水量为2%~5%，移入管式炉中，在400ml/min氮气保护下，以6℃/min的速率加热至600~650℃，保温75~100min，冷却后将样品洗至中性，干燥并磨成粉，过50~100目筛，得到活性碳粉末；

（2）按重量份数比，取1~3份Fe₃O₄微球和20~60份活性炭粉末，超声分散于15~45份蒸馏水中，量取0.5~1.5份浓氨水加入上述体系中，超声搅拌10min；将上述混合液转移至反应釜中，于180˚C高温反应4h，用磁铁分离并收集所得磁性碳微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚C下烘干，得到磁性碳微球；

C.于培养基中接种8%~10%的复合菌液，在37~40℃，180~200r/min条件下摇床培养24~30h，得到发酵液；

所述复合菌液为枯草芽孢杆菌1389和黑曲霉AS3.350；

D.将发酵液巴氏灭菌后，在外加磁场下分离出磁性碳微球，然后用蒸馏水反复洗涤磁性碳微球至洗涤液中无蛋白物质，收集洗涤液；将洗涤液和分离磁性碳微球后的发酵液进行混合得到混合液，按照混合液：磁性二氧化硅体积比=1:2、流速1BV/h条件下通过磁性二氧化硅吸附柱进行吸附，将所得洗脱液进行冷冻干燥，即可得到ACE抑制肽；

所述磁性二氧化硅吸附柱制备方法如下：

（1）取Fe₃O₄微球超声分散于甲苯中，350rpm电动搅拌，分别缓慢加入甲苯体积3%~5%的正硅酸乙酯和三乙胺，室温下搅拌反应24h，用磁铁分离并收集所得磁性二氧化硅微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚C下烘干，得到磁性二氧化硅微球；

所述体系中Fe₃O₄微球含量为4mg/ml甲苯；正硅酸乙酯和三乙胺加入量比为1：1；

（2）按重量份数比，称取20~40份磁性二氧化硅微球超声分散于400~600份pH为8.2的Tris-HCl缓冲液中，350rpm电动搅拌，然后向体系中缓慢加入3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（MPS）和正硅酸乙酯（TEOS），室温下反应16h，用磁铁分离并收集所得丙烯酰基改性磁性二氧化硅微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚C下烘干，得到氨基改性磁性二氧化硅微球；

所述3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（MPS）和正硅酸乙酯（TEOS）用量比为（1~2）：1；体系中Fe₃O₄微球：3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（MPS）=1mg：2~4ml；

（3）将上述氨基改性磁性二氧化硅微球填充于吸附柱中，填充量为80%~90%，得到二氧化硅吸附柱。

2.根据权利要求1所述的一种利用贝肉制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述Fe₃O₄微球制备方法如下：

按重量份数比，称取2~4份FeCl₃·6H₂O溶于60~80份乙二醇中，添加6~8份无水醋酸钠，再加入2~4份聚乙二醇，超声5min，磁力搅拌15min，将反应混合液加入高压反应釜，180˚C高温反应8h，用磁铁分离磁源微粒（Fe₃O₄）产品，依次用无水乙醇，水洗涤3~5次，60˚C烘干，得到Fe₃O₄微球。

3.根据权利要求1所述的一种利用贝肉制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，步骤C所述复合菌液中枯草芽孢杆菌1389和黑曲霉AS3.350比值为2:1。