[发明专利]单亚基RNA聚合酶、其纯化方法及在RNA合成中的应用

权利要求书

1.单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，所述单亚基RNA聚合酶为来自φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶；所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端含有组氨酸标签，所述组氨酸的编码碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

或者，所述单亚基RNA聚合酶为来自φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶，所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端含有FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签中的一种；所述标签与单亚基RNA聚合酶之间由0~10个氨基酸组成保持柔性的肽段连接。

2.根据权利要求1所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，为φKMV类噬菌体KP34的RNA聚合酶，所述标签与KP34的RNA聚合酶之间的肽段由10个氨基酸组成；在KP34的RNA聚合酶与肽段形成的融合蛋白的氨基端处带有如序列表SEQ ID NO.2所示的组氨酸标签。

3.根据权利要求1或2所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA的方法包括如下步骤：S1.获得编码所需RNA的DNA转录模板；S2.加入所述单亚基RNA聚合酶，转录模板，pH7.9 Tris-HCl，氯化镁，亚精胺，DTT，四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNA酶抑制剂，无机焦磷酸酶，DEPC水混合后进行体外转录反应。

4.根据权利要求3所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，步骤S2所述转录反应的时间为1~2h。

5.根据权利要求1或2所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，所述单亚基RNA聚合酶的纯化方法包括如下步骤：（1）镍柱亲和层析：将所述噬菌体的菌体裂解上清液通过镍柱，带所述标签的蛋白与镍柱结合，加入由低浓度到高浓度的咪唑溶液与镍柱竞争结合洗脱蛋白，带有所述标签的目的蛋白在加入高浓度的咪唑溶液时被洗脱，收集目的蛋白；（2）Blue亲和层析：使用5 mL HiTrap Blue HP进行亲和层析，用结合缓冲液平衡5-10个柱体积，控制液体流速为2-5 mL/min；将步骤（1）处理后的蛋白样品以同样的流速过柱，用结合缓冲液洗5-10个柱体积，最后使用5-10个柱体积洗脱缓冲液通过不断提高盐离子强度进行洗脱并收集蛋白；（3）5’-ATP–agarose纯化：将5’-ATP–agarose树脂用水清洗后用中性缓冲液平衡树脂；将步骤（2）处理的蛋白样品过柱，再按由低到高浓度的顺序用含有10-100 mM ATP或ADP的平衡缓冲液进行连续梯度洗脱，并不断提高盐浓度减少非特异结合的蛋白，收集洗脱蛋白；（4）蛋白透析：将步骤（3）获得的蛋白进行多次透析，收集透析后蛋白置于-20℃保存。

6.根据权利要求5所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，步骤（1）所述咪唑溶液的浓度由低到高分别为20 uM、50 uM、100 uM三种浓度，由pH8.0、50 mM磷酸二氢钠和300 mM NaCl对咪唑进行稀释得到。

7.根据权利要求5所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，步骤（2）所述结合缓冲液含有pH 7.0、50 mM磷酸二氢钾或pH 7.0、20 mM磷酸钠；所述洗脱缓冲液含有pH 7.0、50 mM磷酸二氢钾和0-1.5 M KCl，或含有pH 7.0、20 mM磷酸钠、0-2 M NaCl；步骤（3）所述中性缓冲液含有pH 7.5、10 mM HEPES，25 mM NaCl，0.5mM DTT，1 mM EDTA和10%甘油。

8.根据权利要求5所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，所述步骤（4）具体步骤包括：将步骤（3）获得的蛋白加入透析袋中密封后置于1 L透析液中进行透析，2.5~3 h后更换干净透析液继续透析2.5~3 h，最后再次更换透析液透析过夜，收集透析后蛋白保存；所述透析液含有pH 7.5、20 mM磷酸二氢钾，0.1 mMDTT，0.1 mM EDTA，50%甘油。