[发明专利]单亚基RNA聚合酶、其纯化方法及在RNA合成中的应用

说明书

本发明公开单亚基RNA聚合酶、其纯化方法及在RNA合成中的应用。所述的单亚基RNA聚合酶，为来自φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶；或来自与所述φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶的蛋白质序列同源性高于25%并含有如序列表SEQ ID NO.1所示的特征氨基酸序列，且总氨基酸序列数目在800~830之间的其他噬菌体单亚基RNA聚合酶。经研究发现本发明提供的RNA聚合酶与现有的RNA工具酶亲缘关系较远，其转录效率较高。在与现有T7 RNA聚合酶和Syn5 RNA聚合酶相比较时，针对后二者在合成富含稳定高级结构RNA时产物复杂的问题，本发明单亚基RNA聚合酶显示出转录产物均一的显著优点。

技术领域

本发明属于微生物核酸代谢酶研究领域，具体涉及单亚基RNA聚合酶、其纯化方法及在RNA合成中的应用。

背景技术

RNA(核糖核酸)是所有生物遗传信息传递的最重要的一类大分子，同时在生物体内也扮演着多种多样的调控角色。近年来RNA研究已成为生物学研究中最热门的领域之一。RNA主要包括mRNA、tRNA、rRNA等大类，随着近些年生物学技术的快速发展，科学家们发现一些新颖的RNA如microRNA(miRNA)(Cheng et al.,2005)、long non-coding RNA(lncRNA)(Shi et al.,2016)、nanostructure RNA(Geary et al.,2014)等也对生物体发挥着至关重要的作用。设计好的RNA序列可以编码，并可被翻译为任何蛋白质，因此理论上可以替代现存的任何蛋白质药物；且RNA结构相较蛋白质结构要简单得多，容易构建。RNA作为药物的另一个巨大优点是代谢快、半衰期短、翻译产生蛋白质后迅速被降解，相比基因治疗(改变DNA产生永久不可逆的效果)副作用几乎不必考虑。小RNA还可以通过翻译以外的机制如RNA干扰(RNAi)以及RNA指导的基因编辑(CRISPR gRNA)治疗疾病。随着RNA导入细胞方法的完善，以及各种增强稳定性及减少免疫反应的RNA修饰方法的发现，RNA治疗在美国已成为最热门的药物研究方向。大型制药公司如Merck、AstraZeneca、Shire等纷纷投入力量重点开发RNA药物。

正是由于这些围绕RNA的研究和应用相继大量开展，对RNA体外合成在质和量两方面提出了很高的挑战。而RNA的体外制备恰恰是RNA研究和应用的最大瓶颈。由于RNA本身不稳定的性质，RNA的化学合成远不如DNA合成高效，化学合成RNA仅限于小RNA(几到几十个核苷酸长度)，随着RNA长度的增加，化学合成的成本迅速上升。RNA长度达一百个核苷酸以上化学合成法已不再适用(Gallo et al.,2005)，而编码蛋白质的RNA通常都长达几千个核苷酸。目前制备长RNA唯一的方法是体外酶法合成，酶法合成是指在体外以DNA双链为模板利用RNA聚合酶进行转录合成RNA的一种方法，目前这种利用DNA依赖的RNA聚合酶进行体外RNA转录的技术广泛应用于杂交分析、晶体结构研究、生物化学和遗传研究等(Kessler etal.,2017；Romanienko et al.,2016)。这一方法利用一种简单微生物大肠杆菌噬菌体T7的RNA合成机器——单亚基的T7 RNA聚合酶，在体外从带有T7启动子序列的DNA模版上反复转录产生大量所需的RNA。虽然大部分生物自身拥有RNA聚合酶，但是大多都具有复杂的亚基组成和调控机制，不适合用作体外合成RNA的酶工具，只有来源于某些最小最简单的病毒，如T7噬菌体的单亚基RNA聚合酶适合这类用途。自然界中被鉴定的这类单亚基RNA聚合酶只有来源于噬菌体T7、T3和SP6三种，后两种在序列和功能上与T7 RNA聚合酶高度相似因而基本被摒弃，因而对于RNA合成这样一个重要的生物技术人们现在只有一个酶工具可用。