[发明专利]一种CD44在监测非酒精性脂肪性肝病恶化转化过程中的应用

权利要求书

1.一种CD44在监测非酒精性脂肪性肝病恶化转化过程中的应用。

2.根据权利要求1所述的一种CD44在监测非酒精性脂肪性肝病恶化转化过程中的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）动物分组： 随机选取雄性Sprague-Dawley大鼠共94只，其中，随机选取10只为空白对照组，其余84只，随机分配为脂肪肝组和诱癌组各42只；

（2）模型构建：将步骤（1）中的94只雄性Sprague-Dawley大鼠于温度22±2 ℃、12 h光/暗周期和湿度55 %的环境中饲养；空白对照组大鼠予以普通饲料喂养；脂肪肝组大鼠予以高脂饲料喂养；诱癌组大鼠予以高脂饲料加0.05%的2-乙酰氨基芴颗粒饲料喂养；

每两周取1只空白对照组的正常鼠、一组脂肪肝组的高脂鼠和一组诱癌组的诱癌鼠，每组六只大鼠，以乙醚麻醉，经鼠腹心脏抽取5 ml血液，分离血清置-20 ℃保存；摘取鼠肝组织，取每周摘取的鼠肝组织至少3份于10 %中性福尔马林中固定，再取每周摘取的鼠肝组织至少5份于液氮速冻后放-80 ℃冰箱保存为冰冻切片；

将福尔马林固定的鼠肝组织，制备成鼠肝组织石蜡切片；取其中1份鼠肝组织石蜡切片，对鼠肝组织石蜡切片进行病理组织学检查，将鼠肝组织细分为对照组、脂肪肝组、变性组、病变组和癌变组;将相应的-80℃的冰冻切片分为对照组、脂肪肝组、变性组、病变组和癌变组；将鼠血清相应地分为对照组、脂肪肝组、变性组、病变组和癌变组；

（3）肝组织脂肪染色：采用油红O染色进行测试，根据试剂盒要求，按照贮备液：稀释液=5:2的比例配置应用液，并用慢速滤纸过滤；将步骤（2）预先制作好的并保存在-80℃冰箱中的对照组、脂肪肝组、变性组、病变组和癌变组各组鼠肝组织冰冻切片放置室温回温5-10min，然后直接放入装有应用液的染缸中染色10-15min，之后37℃蒸馏水洗5-20s；苏木精复染3-5分钟，37℃蒸馏水洗30-60s；未待表面水干透即可滴加水性封固剂于玻片表面进行封片；在OLYMPUS IX71光镜下进行观察、摄片；通过Image Pro Plus 6.0软件图像分析系统，进行图像分析半定量研究；

（4）血脂和肝酶活性测定：取步骤（2）中的鼠血清进行总胆固醇和甘油三酯水平测定，设空白管、校准管和样本管；在空白管中加入10 µl蒸馏水和1000 µl工作液，校准管中加入10 µl校准品和1000 µl工作液，样本管中加入10 µl样本和1000 µl工作液；将各管混匀后37℃孵育10分钟，取200 µl用酶标仪在波长510 nm测定各孔吸光度A，根据公式计算总胆固醇和甘油三酯含量；

（5）免疫组织化学染色：取步骤（2）中按照病理学分组的对照组、脂肪肝组、变性组、病变组和癌变组各组鼠肝组织的石蜡切片，温水中烫平贴于硅化处理的载玻片上，置于80 ℃干燥箱烤片1-2 h；再将切片置二甲苯中浸泡5 min两次脱蜡，梯度酒精脱水，自来水冲洗5min；先将高压锅水煮沸，加入EDTA缓冲液，所述EDTA缓冲液的pH = 9.0，将玻片置于染色架上放入高压锅中，300 W维持20 min后取出自然冷却至室温，PBS冲洗5 min三次，在每张切片上滴加3 % H2O2，室温孵育15 min，PBS冲洗5 min三次；滴加1:500的CD44抗体，室温孵育1h，PBS冲洗5 min三次，甩去多余水分，滴加反应增强液室温孵育20 min，PBS冲洗5 min三次，后滴加酶标抗小鼠/兔免疫球蛋白G聚合物，室温孵育30 min，PBS冲洗5 min三次；将配好的DAB染液滴加到组织上5 min，观察显色程度，反应结束后自来水冲洗5 min，然后苏木素复染10-30 s，流水冲洗，盐酸-乙醇分化5-10 s，流水冲洗，温水蓝化5 min；最后梯度酒精脱水，吹干切片，中性树脂封固组织切片，光镜OLYMPUS MX53观察、摄片，通过Image ProPlus 6.0软件图像分析系统测定每个视野的累积积分光密度值及有效统计区域的面积，计算光密度平均值，取其平均值代表肝组织中CD44表达的相对水平，进行图像分析半定量研究。