[发明专利]一种基于MGB探针的水貂毛皮制品真伪的鉴定方法

权利要求书

1.一种利用MGB探针的荧光定量PCR法对水貂毛皮制品进行真伪鉴定的方法，其特征在于包括特异性引物和探针的序列如下：

水貂上游引物NvF：5’—GCATGAGCCGGAATAGTAGGAA—3’

水貂下游引物NvR：5’—GCGCCAGGTTGACCTAGTTC—3’

水貂探针NvP：5’—(FAM)CTCTTAGTCTTCTAATCCGTG(MGB)—3’

2.根据权利1所述的利用MGB探针的荧光定量PCR法对水貂毛皮制品进行鉴定的方法，其特征在于构建20μl荧光反应体系，由以下组分组成：

3.一种采用如权利1、权利2所述的利用MGB探针的荧光定量PCR法对水貂毛皮制品进行鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：

A、提取样品DNA。

B、对步骤A中的样品DNA进行荧光定量PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：FastStart Universa Probe Master(Rox)10μl，上游引物NvF 0.5μl，下游引物NvR 0.5μl，MGB探针0.5μl，DNA模板7μl，ddH₂O 1.5μl。qPCR反应程序为：95℃10min；95℃10s，60℃30s(收集荧光信号)，50个循环；60℃1min。

所述的引物和探针：

水貂上游引物NvF：5’—GCATGAGCCGGAATAGTAGGAA—3’

水貂下游引物NvR：5’—GCGCCAGGTTGACCTAGTTC—3’

水貂探针NvP：5’—(FAM)CTCTTAGTCTTCTAATCCGTG(MGB)—3’

C、对扩增后的曲线情况进行结果判定，按照以下判定原则：

Ct值小于等于35并有明显扩增曲线判为阳性；Ct值大于等于40判为阴性；Ct值介于35～40之间判为可疑，DNA模板加倍重复实验，如果Ct值比原来减小并拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。

4.根据权利3所述的检测方法，其特征在于步骤B所述的荧光定量PCR扩增按照以下步骤进行：

95℃10min；95℃10s，60℃30s(收集荧光信号)，50个循环；60℃1min。

5.根据权利3所述的检测方法，其特征在于步骤A所述的样品DNA提取按照以下步骤进行：

取水貂针毛至少10根(平均1～2cm)或绒毛5mg放置于2ml离心管中，剪碎，加入280μlTNE、30μl SDS、20μl DTT、20μl蛋白酶K，加入150μl Buffer C-L(AXYGEN动物基因组提取试剂盒)，立即涡旋振荡1min混合均匀。瞬时离心后，将离心管置于56℃水浴中过夜消化处理。离心步骤参照AXYGEN动物基因组提取试剂盒说明书进行，加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管至于2ml离心管中，将离心后的上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液，离心1min。将DNA制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的Eluent洗脱液80μl洗脱DNA，-20℃冷冻备用。