[发明专利]一种基于MGB探针的水貂毛皮制品真伪的鉴定方法

说明书

本发明公开了一种基于MGB探针的荧光PCR法鉴定水貂物种特异性的检测方法，包括水貂上游引物：NvF；水貂下游引物：NvR；水貂MGB探针：NvP(5’端标记FAM)；检测方法：提取样品毛的DNA；对样品DNA进行荧光定量PCR扩增；根据Ct值和扩增曲线判定结果。通过特异性实验、灵敏度实验、重复性实验和盲测实验，结果表明，本发明具有高度特异性和灵敏性，可适用于快速、准确地检测水貂毛皮制品的真伪，具有广泛的应用前景和较高的实用价值。

技术领域

本发明涉及MGB探针的实时荧光定量PCR法对水貂毛皮制品的真伪进行鉴定的方法，属分子生物学领域。本发明检测方法快速、准确。

背景技术

我国北方地区天气寒冷，水貂皮保暖美观，雍容华贵，价格也很昂贵。貂皮行业利润丰厚，加工工艺复杂，经常发生以其他毛皮充当水貂皮的情况，而传统的毛皮制品检验方法如直观观察法、扫描电镜法、DNA测序法等因各自的局限性已无法满足貂皮制品准确鉴定的需要。

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是在常规PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个反应进程。其中，TaqMan探针法灵敏度高，对目标序列具有高特异性，可分辨单个碱基突变，重复性好。但常规TaqMan探针法荧光本底值偏高，荧光淬灭不彻底。而MGB探针法，3’端标记不发光的淬灭荧光分子并结合MGB结合物，基于水解探针原理，当溶液中有PCR模板时，探针与模板退火，产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏了荧光分子间的荧光共振能量转移，发出荧光。因此，每扩增一条DNA链，就对应有一个荧光基团信号，保证荧光信号的累计与PCR产物的形成完全同步。该方法特异性好、灵敏度高。

本发明建立了一种针对水貂毛皮制品真伪识别的MGB探针的实时荧光定量PCR方法，利用国际上广泛认可的作为DNA条码的线粒体COI基因为模板设计引物和MGB探针，准确、高效地检测水貂毛皮制品的真伪。

发明内容

本发明的第一个目的是设计针对水貂的物种特异性引物和探针。

本发明的第二个目的是建立快速、准确识别水貂毛皮制品真伪的检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

1、DNA的提取体系

取水貂针毛至少10根(平均1～2cm)或绒毛5mg放置于2ml离心管中，剪碎，加入280μl TNE、30μl SDS、20μl DTT、20μl蛋白酶K，加入150μl Buffer C-L(AXYGEN动物基因组提取试剂盒)，立即涡旋振荡1min混合均匀。瞬时离心后，将离心管置于56℃水浴中过夜消化处理。离心步骤参照AXYGEN动物基因组提取试剂盒说明书进行，加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管置于2ml离心管中，将离心后的上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液，离心1min。将DNA制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的Eluent洗脱液80μl洗脱DNA，-20℃冷冻备用。

2、引物和探针的设计

选取Genbank上已发表的水貂线粒体COI序列(KU146454、KM488625和HM106322)以及相关物种同源序列，利用MegAlign进行比对后，选择水貂物种特异的碱基序列，利用ABIprimer express 3.0设计引物与MGB探针，Primer 6.0分析引物二级结构，将所设计的引物和探针利用Blast再次进行比对分析，确保引物与探针的特异性。

引物和探针设计结果：