[发明专利]一株草鱼肌肉组织细胞系及应用

权利要求书

1.一株草鱼肌肉组织细胞株，其保藏号是：CCTCC NO .C201833。

2.权利要求1所述的草鱼细胞株在草鱼呼肠孤病毒的分离、繁殖及病毒疫苗研制中的应用。

3.一种草鱼细胞系的构建方法，其步骤是：

1)取草鱼肌肉组织，灭菌处理，剪成碎末接种，培养箱中干贴，加入细胞培养液培养，第6天细胞开始迁出；用PBS清洗，加入含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞变圆后，用培养液洗脱，离心收集细胞培养，每2天更换培养液，至细胞长成80％-90％汇合的原代肌肉细胞；

2)原代草鱼肌肉细胞铺满单层后，除去培养液，PBS清洗，以含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞脱壁，吸去消化液，加入细胞培养液分散、悬起细胞，传代培养；

原代细胞的收集方法是：待细胞开始从剪碎的肌肉组织迁出后3-4天，PBS清洗，加入胰酶消化细胞，用细胞培养液A洗脱，汇合细胞洗脱液，离心收集细胞至新的细胞瓶培养瓶中进行原代培养。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，灭菌处理的方法是：先用75％酒精中浸泡肌肉组织1～2min，用含有100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的PBS溶液清洗。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，消化细胞的含有EDTA的胰酶浓度为0.25％。

6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，传代培养的方法是：原代草鱼肌肉细胞铺满单层后，除去培养液，PBS清洗，以胰酶消化细胞，待细胞脱壁，吸去消化液，加入细胞培养液A分散、悬起细胞，以1：2进行传代，置28℃培养箱中传代培养；以后4～6天传代一次；第3代起，细胞培养液A中不再添加青霉素、链霉素成分；传至第10代，改用传代细胞培养液B，此时细胞系建成；传至第20代起，改用传代细胞培养液C。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，细胞培养液A是含有20ng /mL bFGF、1ng/mL EGF、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素液，pH为7.0-7.4的M199培养基。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，细胞培养液B是含有10％FBS，20ng/mLbFGF，3ng/mL EGF的M199培养基。

9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，细胞培养液C是含有10％FBS的M199培养基。