[发明专利]一株草鱼肌肉组织细胞系及应用

说明书

本发明公开了一株草鱼肌肉细胞株及其制备方法，该细胞株的保藏号是：CCTCC NO.C201833；其制备步骤是：1)取草鱼肌肉组织，灭菌处理，剪成碎末接种中，培养箱中干贴，加入细胞培养液培养，第6天细胞开始迁出；用PBS清洗，加入含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞变圆后，用培养液洗脱，离心收集细胞培养，每2天更换培养液，至细胞长成80％‑90％汇合的原代肌肉细胞；2)原代草鱼肌肉细胞铺满单层后，除去培养液，PBS清洗，以含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞脱壁，吸去消化液，加入细胞培养液分散、悬起细胞，传代培养。本发明的制备方法简单，制备出来的细胞株可很好地应用于草鱼呼肠孤病毒的分离、繁殖及草鱼出血病疫苗的研制。

技术领域

本发明涉及细胞学技术领域，特别涉及一株草鱼肌肉组织细胞系及其应用。

背景技术

草鱼(Ctenopharyngodonidellus)属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，是中国淡水养鱼的主要品种，其产量约占淡水养殖总产量的20％。由于现有的草鱼养殖常以高密度放养、大量施肥、投饵的模式获取高产，使得养殖水体恶化严重，诱使鱼体病害频发，尤其以呼肠孤病毒(GCRV)引起的病毒性出血病最甚，直接影响草鱼养殖的经济效益。目前针对病毒性出血病的防治除了免疫“草鱼出血病活疫苗(GCHV-892株)”，并无其它有效手段，且该疫苗对不同基因型呼肠孤病毒的作用有限。所以，对研究草鱼出血病病毒及其感染途径、感染机理以及不同基因型病毒疫苗的研制等极具意义。

细胞是病毒研究及新型疫苗研制最为重要的材料和工具，建立对GCRV敏感的、可稳定传代的细胞系，是进行草鱼出血病病毒的分离与鉴定、研究其致病机理、疫苗制备和免疫预防技术的重要基础。自从1962年第一个硬骨鱼类细胞系—虹鳟鱼性腺细胞系RTG-2成功构建以来，已有近300株不同的鱼类细胞系相继建立，组织来源包括胚胎及成鱼的肾脏、心脏、脾脏、鳍条、性腺、脑、肌肉、皮肤等。迄今为止，由草鱼组织建立的细胞系已报道的有：草鱼肾脏细胞系、草鱼吻端组织细胞株ZC-7901及其亚株ZC-7901S1、吻端成纤维细胞系PSF、草鱼尾鳍组织二倍体细胞系、草鱼囊胚细胞系、肝细胞系、鳔细胞系等几个细胞系。根据草鱼出血病病鱼所表现的症状及病理变化，大致可以将草鱼出血病分为“红肌肉型”、“红鳍红鳃盖型”、“肠炎型”三种类型，肌肉是易被GCRV感染的一个常见靶器官。但是，目前尚没有比较易于用于实验的草鱼肌肉细胞系。

发明内容

本发明的目的在于提供一株草鱼肌肉细胞系及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一株草鱼肌肉组织细胞株，其保藏号是：CCTCC NO.C201833。

该草鱼细胞株在呼肠孤病毒的分离、繁殖及病毒疫苗研制中的应用。

一种草鱼细胞系的构建方法，其步骤是：

1)取草鱼肌肉组织，灭菌处理，剪成碎末接种中，培养箱中干贴，加入细胞培养液培养，第6天细胞开始迁出；用PBS清洗，加入含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞变圆后，用培养液洗脱，离心收集细胞培养，每2天更换培养液，至细胞长成80％-90％汇合的原代肌肉细胞；

2)原代草鱼肌肉细胞铺满单层后，除去培养液，PBS清洗，以含EDTA的胰酶消化细胞，待细胞脱壁，吸去消化液，加入细胞培养液分散、悬起细胞，传代培养。

优选的，灭菌处理的方法是：先用75％酒精中浸泡肌肉组织1～2min，用含有100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的PBS溶液清洗

优选的，消化细胞的含有EDTA的胰酶浓度为0.25％。

优选的，原代细胞的收集方法是：待细胞开始从剪碎的肌肉组织迁出后3-4天，PBS清洗，加入胰酶消化细胞，用细胞培养液A洗脱，汇合细胞洗脱液，离心收集细胞至新的细胞瓶培养瓶中进行原代培养。