[发明专利]一种胎盘间充质干细胞冻干粉的制备方法

权利要求书

1.一种胎盘间充质干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

⑴、胎盘干细胞的分离和培养：在无菌条件下，收取健康的胎盘，在GMP实验室生物安全柜将胎盘剪碎至1.5-2.5mm³大小的组织块，将其置于T175培养瓶所盛的DMEM-LG细胞培养液中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养；每隔2-3天换液，直至胎盘干细胞析出，弃去组织块；细胞长满后，记为第一代，用0.28％胰酶进行消化传代；第二代后改用无抗生素DMEM-LG培养基，并进行传代培养；

⑵、细胞因子的收集：第三代后，细胞长至90％左右可开始收集细胞因子；将细胞状态良好的细胞收集起来，进行超声破碎，使其将细胞内未完全释放的细胞因子释放出来；并1500rpm离心10分钟，去除细胞碎片沉淀；

⑶、干细胞提取物的超低温冻干：将去除细胞碎片沉淀的胎盘干细胞培养原液加入10％BSA作为赋形剂，充分溶解后，用0.45um的无菌过滤器过滤除菌，并分装至2ml西林瓶中，每瓶1ml；分装后将西林瓶置于-80℃超低温冰箱中进行预冻干，预冻12h后取出，再置于冻干机内冷冻干燥；即得到胎盘间充质干细胞冻干粉。

⑷、冻干前后干细胞因子的活性检测：配制冻干粉溶媒；利用3T3细胞的增殖曲线，模拟成纤维细胞在细胞因子促进下的生长情况；将3T3培养后，采用胰酶消化，计数后，将细胞铺至四块六孔板，每两块一组，且每块四孔，其中每孔1*103个细胞；设定第一组为对照组，在所述对照组中添加步骤⑵中收集的细胞；设定第二组为实验组，在所述实验组中添加冻干后用溶媒溶解的细胞因子；分别培养24h、48h、72h、96h后，每板取1孔计数，绘制生长曲线。

2.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤⑴中所述DMEM-LG细胞培养液中含10％FBS、bFGF 5ng/mL、L-谷氨酰胺2mM、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL和两性霉素B 1μg/mL。

3.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤⑴中所述无抗生素DMEM-LG培养基含10％FBS、bFGF 5ng/mL、L-谷氨酰胺2mM。

4.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤⑶中所述冻干机为真空冷冻干燥机。

5.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤⑷中所述冻干粉溶媒为2％透明质酸、10％甘油及双蒸水。