[发明专利]一种胎盘间充质干细胞冻干粉的制备方法

说明书

本发明利用组织快法制备了胎盘干细胞，并采用超声波破碎法收集细胞内的细胞因子与上清中的细胞因子混合，在低温环境下冻干，充分保证了胎盘干细胞因子的浓度及活性。本发明的制备方法所制备的冻干粉有效地保存了人胎盘间充质干细胞中的各种具有生物活性的细胞因子混合物，保存期可延长到2年，有效地解决细胞因子溶液保存期有限这一瓶颈，为人胎盘间充质干细胞细胞因子的产业化应用奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种胎盘间充质干细胞冻干粉的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的成体干细胞，可刺激组织生长和修复，增强组织的再生能力，影响免疫调节，在细胞治疗领域有着极为广阔的应用前景。MSCs可从骨髓、脐带血、脂肪、滑膜、胎盘、结缔组织等部位获得。

然而，MSCs在组织中的丰度极低，因此，体外培养是实现MSCs应用价值的必需步骤，研究表明，与新鲜分离的MSCs不同，细胞经体外培养扩增后，其生物学特性会发生很大的变化，并随着培养时间的延长，细胞分化的能力逐渐丧失，这与体内外细胞所处的环境有关，体内的微环境组成相当复杂，不可能用稳定的温度、pH值和营养成分这些体外因素所模拟的。如何短时间获取大量功能状态良好的MSCs，维持MSCs的原始状态，及控制MSCs分化方向是当前研究的热点也是难点。另外，越来越多的证据表明，无论静脉注射还是局部注射，体外培养的MSCs进入到体内后，只有极少量的细胞生存，而这少数存活的细胞通过分泌大量的小分子物质，例如，细胞因子、生长因子、趋化因子等而发挥作用。

胎盘间充质干细胞是一种多能干细胞，是具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞像APSC多能细胞。相较于其他干细胞，胎盘间充质干细胞具有来源方便，细胞数量充足，易于分离、培养、扩增和纯化，传代扩增30多代后仍具有干细胞特性。胎盘是目前证实干细胞的最佳来源。

在胚胎发育中来源于中胚层。在机体正常的组织损伤修复过程中，胎盘间充质干细胞一种重要的参与组织再生的细胞库。在组织损伤引起的特殊信号作用下，胎盘间充质干细胞迁移到受损部位，在局部聚集增殖，依据不同的损伤信号沿着不同途径分化。胎盘间充质干细胞易于分离扩增，体外倍增能力旺盛，即使扩增1亿倍仍能保持其多向分化能力。因此，胎盘间充质干细胞是一种实用的组织修复种子细胞。胎盘干细胞具有免疫调节作用，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡，从而可以用来治疗造血干细胞移植之后的免疫排斥反应以及克隆氏病、红斑狼疮，硬皮病等自身免疫系统疾病。

干细胞在美容行业应用广泛。干细胞提取物一般是指干细胞培养液上清液及(或)细胞裂解液，其细胞培养液上清液含有大量的具有多种生物活性的蛋白质、多肽及细胞因子，它们参与细胞结构的维持运动信息交流以及组织修复与再生，具有较好的抗光老化、抗氧化、抗皱、美白肌肤、伤口愈合、细胞修复等功效。因此，随着干细胞提取物的应用价值越来越受到人们的关注，如何获得大量的、质量稳定可控的干细胞提取物成为人们致力研究的问题。干细胞上清液可以直接进行涂抹，操作简便。但是，液态的培养上清在常温保存时间短，这就阻碍了它的推广和应用。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种胎盘间充质干细胞冻干粉的制备方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种胎盘间充质干细胞冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

⑴、胎盘干细胞的分离和培养：在无菌条件下，收取健康的胎盘，在GMP实验室生物安全柜将胎盘剪碎至1.5-2.5mm³大小的组织块，将其置于T175培养瓶所盛的DMEM-LG细胞培养液中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养；每隔2-3天换液，直至胎盘干细胞析出，弃去组织块；细胞长满后，记为第一代，用0.28％胰酶进行消化传代；第二代后改用无抗生素 DMEM-LG培养基，并进行传代培养；