[发明专利]用于治疗勃起障碍的干细胞制剂的制备和使用方法

权利要求书

1.一种用于治疗勃起障碍的干细胞制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：血管内皮干细胞的培养、血管内皮干细胞的鉴定及检测、血管内皮干细胞的冻存、及血管内皮干细胞制剂的制备与激活；其中，

所述血管内皮干细胞的培养，包括以下步骤：

①带无菌手套，取出选好的健康脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除；

②在脐带一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用2根粗丝线扎牢，用30ml注射器抽吸Cord Buffer冲洗静脉腔，至将脐血洗净；

③赶出静脉腔内残余液体，将脐带另一端用止血钳夹闭，用10ml注射器连接针头，注入37℃预热的0.1％胶原酶约6-8ml，放入37℃Cord Buffer中保温6-10min；

④吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20ml cord Buffer的离心管中，再冲洗静脉腔，一并加入离心管中；

⑤离心，1500rpm，10min，弃上清，收集细胞；

⑥配制培养液：

⑦用新鲜配制的培养液重悬步骤⑤所收集的细胞，吸入T75培养瓶；

⑧置于37℃、5％CO₂培养；

⑨细胞长至80-90％左右，开始消化、传代；

所述血管内皮干细胞的鉴定及检测，包括流式鉴定、内毒素检测、真菌细菌检测和支原体检测；

所述血管内皮干细胞的冻存，包括：将经流式、内毒素、真菌、细菌及支原体检测合格的细胞进行冻存；去除培液，用PBS清洗细胞两次；加入3mL胰酶消化细胞；摇晃培养瓶使胰酶覆盖细胞单层；倒出多余的胰酶，将培养瓶放回培养箱，放置1min，用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮，轻拍培养瓶的一侧来释放残留的贴壁细胞；加入10mL含血清的培液终止消化；取出100-200μL用于计数；将剩余的细胞1000rpm离心5min，在冻存液中，以2×106个细胞/mL的密度重悬细胞，吸取5mL细胞悬液转移至标有细胞系名称、传代次数、冻存日期的冻存管中，将冻存管放置在4℃冰箱30min，之后放入-20℃冰箱中2小时左右，再放入-80℃冰箱过夜，最后将冷冻的冻存管转移到液氮罐中保存；

所述血管内皮干细胞制剂的制备与激活，包括以下步骤：

先从液氮罐中取出冻存的血管内皮干细胞，立即置于37℃水浴锅中水浴；在1000rpm离心5min，则将血管内皮干细胞复苏；将复苏后的细胞用生理盐水重悬、洗涤，1000rpm，离心5min，去上清，再重复洗涤一次；然后，加入2ml激活剂重悬细胞，细胞重悬后，室温静置孵育15min激活后，吸入两支1ml胰岛注射器内。

2.根据权利要求1所述的用于治疗勃起障碍的干细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述血管内皮干细胞的鉴定及检测，包括以下步骤：

⑴、流式鉴定：收集P9代细胞，离心并再悬浮于1XPBS，于细胞计数仪上计数；细胞与CD45、CD34孵育；所有抗体均直接标记；培育后，收集细胞，离心并重悬于1XPBS，立即采用流式细胞仪检测；

⑵、内毒素检测；内毒素检测使用湛江安度斯鲎试剂检测，检测结果样品为阴性；

⑶、真菌细菌检测；采用培养法检测，取细胞悬液分别接种到马丁培养基、琼脂糖培养基、硫乙醇酸盐培养基，各两块；并做阳性及阴性对照；分别于30℃及37℃培养，24h，48h后观察结果；结果显示，细胞悬液呈阴性；

⑷、支原体检测：采用培养法检测，试剂采用珠海银科支原体检测试剂盒，培养48h检测结果呈阴性。

3.根据权利要求1所述的用于治疗勃起障碍的干细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述激活剂的配制为：100pg/VEGF+10％人血白蛋白+90％生理盐水。

4.一种权利要求1中所述的用于治疗勃起障碍的内皮干细胞制剂的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：先对患者阴茎部位消毒，采用专用的注射针头将激活的血管内皮干细胞制剂注射到两条海绵体内，所述注射针头与阴茎平行进入阴茎海绵体外层，向前推进达阴茎根部，然后匀速后退，在后退的过程中，将药物均匀地注射入阴茎海绵体内，共注射8点，每次注射完后按压止血；最后用止血带扎住阴茎根部15-20min，促进激活的血管内皮干细胞的归巢。