[发明专利]一种用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法

权利要求书

1.一种用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

⑴、脐带、胎盘间充质干细胞的分离培养

在无菌条件下，收取健康的脐带和胎盘；在GMP实验室生物安全柜将胎盘剪碎至1.5-2.5mm³大小的组织块，将所述组织块分别置于T175培养瓶所盛的DMEM-LG细胞培养液中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养；

每隔2-3天换液，直至有大量干细胞爬出后，弃去组织块；细胞长满后，记为第一代，用0.28％胰酶进行消化传代；第二代后改用无抗生素DMEM-LG培养基进行培养；依次传代培养；

⑵、脂肪间充质干细胞的分离培养

在无菌条件下，获取健康人的脂肪组织100mg；将所述脂肪组织放入超净台中，用PBS反复冲洗，直至无明显血污；收集到离心管中，加入0.5％的胰酶和0.1％胶原酶各10ml，将离心管密封，放入37℃恒温摇床中，180r×min^-1，震荡消化30min；消化后从所述恒温摇床上取出，在1000rpm的条件下离心10min，去上清，以去除悬浮脂肪；再用0.16mol/L的NH4Cl溶解红细胞，PBS洗涤3次，200目过滤，分离单个核细胞；移入DMEM-LG培养基进行培养；同步骤⑴中进行消化传代；

⑶、脐带、胎盘和脂肪三种间充质干细胞培养上清中的细胞因子检测

将步骤⑴和步骤⑵中的干细胞培养至第五代时，收集培养上清，用Elisa法检测所述干细胞因子浓度，包括EGF、PDGF和VEGF；

⑷、脐带、胎盘和脂肪三种间充质干细胞培养上清调配及检测

将步骤⑴和步骤⑵中获取的脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脂肪间充质干细胞三种培养上清以1：1：1配比，检测混合液与单独上清对3T3细胞增殖的刺激作用；

将3T3细胞培养至最佳状态，胰酶消化，计数后，将细胞铺至八块六孔板上，每两块板为一组，每块板上设有四孔，每孔内铺1×103个细胞，分别添加步骤⑶及步骤⑷调配的上清；并培养24h、48h、72h、96h后，每板取1孔计数，绘制生长曲线；从曲线可以发现，三种干细胞培养上清分别刺激3T3的生长无明显差异，而复合上清刺激3T3的生长在72h刺激后开始有所差异；

⑸、种间充质干细胞培养上清的冻干粉制备

将步骤⑴和步骤⑵中获取的脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脂肪间充质干细胞三种培养上清加入10％BSA作为赋形剂，充分溶解后，0.45um过滤装入冻干瓶中；将冻干瓶置于-80℃进行预冻，预冻24h后取出置于冻干机冻干；

⑹、冻干粉溶媒的配制

将1％透明质酸、10％甘油、5％丁二醇，其余为双蒸水，配制成冻干粉溶媒，高温高压灭菌30min后，分装备用。

2.根据权利要求1所述的用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法，其特征在于：所述DMEM-LG细胞培养液中含10％FBS、bFGF 5ng/mL、L-谷氨酰胺2mM、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL和两性霉素B 1μg/mL。

3.根据权利要求1所述的用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法，其特征在于：步骤⑴中所述无抗生素DMEM-LG培养基含10％FBS、bFGF 5ng/mL和L-谷氨酰胺2mM。

4.根据权利要求1所述的用于多重干细胞复合冻干粉及溶媒的制备方法，其特征在于：所述冻干机为真空冻干机。