[发明专利]一种快速筛选合成米格列醇关键中间体突变菌株的方法及菌株

说明书

本发明提供了一种快速定量检测米格列醇关键中间体突变菌株的方法及菌株，所述方法将野生氧化葡糖杆菌经诱变处理后的诱变菌株进行发酵培养，取发酵培养后的诱变菌株湿菌体细胞加入底物反应液中，在15℃转化反应完全后，将反应液离心，测上清中6NSL含量，根据6NSL含量的高低来筛选获得合成米格列醇关键中间体的高活力突变菌株。本发明所提供的检测方法具有简便、快捷、特异性高，重复性好等特点，该方法能够进一步应用于高活力氧化葡糖杆菌的筛选，有效加快育种进程，筛选获得的突变菌株转化合成米格列醇中间体6NSL催化能力显著提升，适用于米格列醇的工业化大规模生产。

(一)技术领域

本发明涉及一种快速定量检测米格列醇关键中间体6-脱氧-6-氨基 (N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖(6NSL)的方法。

(二)背景技术

米格列醇[1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇，miglitol]，为葡萄糖结构类似物(如图1所示)，是德国拜耳(Bayer)公司开发的一种新型α-糖苷酶抑制剂类降糖药物，其对胰淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有高亲和力，能够抑制二糖、多糖和复合糖的水解，延缓葡萄糖和其它单糖的吸收，降糖效果明显，毒副作用明显低于磺酞脉类及双肌类药物，已经成为治疗 II型糖尿病的重要治疗药物之一。

US4246345，US4806650，US5401645等公开了以N-羟乙基葡萄糖胺为底物用化学生物组合法合成米格列醇的工艺路线是目前合成米格列醇的主要技术路线，该底物由葡萄糖和乙醇胺经一步化学加氢过程合成，引入氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)对底物N-羟乙基葡萄糖胺进行 4-羟基的选择性不对称氧化，获得的中间产物直接耦合化学加氢环化合成米格列醇。该工艺较传统的全化学合成具有合成工艺路线短，成本低，产量较高的优势。其中，氧化葡糖杆菌不对称选择性氧化是该路线的关键限制步骤，其合成的中间体为6-脱氧-6-氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖 (6NSL)，化学式为C₈H₁₇NO₆。传统的化学生物组合法合成米格列醇的工艺路线缺乏对工艺节点中的米格列醇关键中间体6NSL的快速定量检测方法，仅通过对底物N-羟乙基葡萄糖胺的薄层色谱定性分析及对产物米格列醇的终端检测，缺乏对整个合成工艺进行及时、有效的检测监控。

前期文献报道了中间体6-脱氧-6氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖 (6NSL)的异构化及其稳定性会显著影响米格列醇的最终产率。因此，在 G.oxydans催化合成6NSL及化学加氢合成米格列醇工艺中，山梨醇脱氢酶高效催化、6NSL的稳定存在条件及与化学氢化高效耦合需要寻找一个合适的平衡工艺条件，才能够最终实现米格列醇的快速转化及高效合成，而对转化过程中重要中间体6NSL的快速定量方法是监控整个转化过程的基础。已有的专利和文献未见针对6NSL的快速定量检测的相关报道。此外，目前国内尽管已有制取米格列醇中间体的菌株的相关报道，如 CN101302549，CN105968042A，CN104693109A等，但由于氧化葡糖杆菌发酵单位的菌体量少，N-羟乙基葡萄糖胺脱氢酶的活力相对较弱，催化进程较慢，底物浓度及转化率较低，限制了米格列醇的生产水平，亟需建立高活力菌株的高效筛选方法，而以米格列醇关键中间体6NSL快速定量检测方法为技术平台建立的高通量筛选方法，能够有效加快高活力催化合成米格列醇中间体6NSL菌株的选育进程，为我国米格列醇生产工艺的进一步提升奠定基础。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种快速定量检测米格列醇关键中间体6-脱氧-6- 氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖的方法，并结合诱变选育筛选获得了一株高活力氧化葡糖杆菌突变菌株ZJB16009，并将该菌株应用于催化合成米格列醇中间体6NSL，以克服现有米格列醇合成工艺中关键转化中间体监控技术缺乏、底物投料浓度低、转化进程慢等局限。

本发明采用的技术方案是：