[发明专利]一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒

说明书

本发明公开了一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒，该方法包括如下步骤：以待测样品为模板，采用试剂盒进行PCR扩增，得到反应产物；读取反应产物的荧光信号，然后判断待测样品中是否含有瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌。试剂盒包括引物对组合，组成引物对组合的4条引物的核苷酸序列依次如序列表中序列3至序列6所示。实验证明，在LGC分子检测平台上，采用本发明提供的试剂盒可以高通量快速检测瓜类种子上是否携带瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌，可作为防控感染种子流转的预防技术，也可作为田间种植阶段的病害监测预警技术，为农业生产及口岸检疫提供了一种快速、准确的检测方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒。

背景技术

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch，简称BFB)，又称细菌性果腐病，是西瓜和甜瓜生产中一种毁灭性病害，也是世界性检疫病害。BFB是典型的由种子带菌引起的传染性病害，由西瓜嗜酸菌(Acidovorax.citrulli)引起，具有发病快、传播速度快、爆发力强、危害重等特点，可侵染西瓜、甜瓜、南瓜、西葫芦、黄瓜等多种瓜类作物，给农业安全生产造成严重威胁。西瓜嗜酸菌不仅危害果实，也在幼苗期引起子叶和真叶腐烂枯死的症状；其主要存活于种皮下的胚乳表层，具有存活时间长、抗逆、抗干旱、抗衰老能力和致病力强的特点。

瓜类细菌性角斑病是一种重要的细菌性种传病害，其散布快、传播范围广。瓜类细菌性角斑病最初在黄瓜上发现，如果黄瓜遭遇此病害，严重时可导致绝产，造成严重经济损失。瓜类细菌性角斑病的病原菌为丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病变种(Pseudomonassyringae pv.lachrymans)，其寄主非常广泛，除侵染黄瓜外，还可以侵染西瓜、葫芦、西葫芦和丝瓜等葫芦科植物，造成严重经济损失。

植物病原细菌检测中常用手段包括出苗检测、生化培养检测、免疫学检测及以PCR为基础的分子检测方法，这些检测手段因识别对象的不同而各具优缺点。LGC分子检测平台是基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)技术的SNP基因分型检测方案(英国政府化学家实验室开发)。截止目前，还没有高通量快速检测瓜类种子上是否携带西瓜嗜酸菌和丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病变种的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测待测瓜类种子上是否携带瓜类细菌性果斑病菌和/或角斑病菌。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了引物对组合，可包括引物对AC-3和引物对PSL-7；

所述引物对AC-3可由引物AC-F和引物AC-R组成；所述引物对AC-3的靶序列可含有特异DNA片段甲；所述特异DNA片段甲可为如下y1)或y2)：

y1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

y2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物对PSL-7可由引物PSL-F和引物PSL-R组成；所述引物对PSL-7的靶序列可含有特异DNA片段乙；所述特异DNA片段可乙为如下z1)或z2)：

z1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

z2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。

上述引物对组合中，所述引物对AC-3中一条引物的5’末端可含有接头序列甲；所述引物对PSL-7中一条引物的5’末端可含有接头序列乙；接头序列甲和接头序列乙可结合不同的信号基团。

上述引物对组合中，所述接头序列甲的核苷酸序列可如序列表中序列3自5’末端起第1至21位所示。所述接头序列甲可结合FAM信号基团。所述接头序列乙的核苷酸序列可如序列表中序列5自5’末端起第1至22位所示。所述接头序列乙可结合HEX信号基团。